Characterization of Single Channel Currents from Primary Cilia of Renal Epithelial Cells

Le cil primaire est un organite microtubulaire omniprésent et non mobile dépourvu de la paire centrale de microtubules que l'on trouve dans les cils mobiles. Les cils primaires sont entourés d'une membrane, qui a un complément unique de protéines membranaires, et peuvent donc être fonctionnellement différents de la membrane plasmique. La fonction du cil primaire reste largement inconnue. Cependant, les cils primaires ont d'importantes propriétés de transducteur sensoriel, y compris la réponse des cellules épithéliales rénales à l'écoulement de fluide ou à la stimulation mécanique. Récemment, des maladies kystiques rénales ont été associées à des protéines ciliaires dysfonctionnelles. Bien que les propriétés sensorielles des cils primaires épithéliaux rénaux puissent être associées à l'activité des canaux fonctionnels dans l'organite, les informations à cet égard font encore défaut. Cela peut être lié aux difficultés inhérentes à l'évaluation de l'activité électrique dans cet organite plutôt petit et étroit. Dans la présente étude, nous fournissons la première preuve électrophysiologique directe de la présence de courants à canal unique à partir de cils primaires isolés de cellules épithéliales rénales LLC-PK1. Plusieurs phénotypes de canaux ont été observés, et l'ajout de vasopressine a augmenté l'activité des canaux cationiques, ce qui suggère la régulation, par la voie de l'AMPc de la conductance ciliaire. La reconstitution des canaux ioniques des membranes ciliaires par rapport aux membranes plasmiques a indiqué une densité de canaux beaucoup plus élevée dans les cils. Au moins trois protéines de canal, la polycystine-2, TRPC1 et, fait intéressant, le canal sodique α-épithélial, ont été immunodétectées dans cet organite. L'activité des canaux ioniques dans le cil primaire des cellules rénales peut être un élément important de son rôle de transducteur sensoriel. Le cil primaire est un organite microtubulaire omniprésent et non mobile dépourvu de la paire centrale de microtubules que l'on trouve dans les cils mobiles. Les cils primaires sont entourés d'une membrane, qui a un complément unique de protéines membranaires, et peuvent donc être fonctionnellement différents de la membrane plasmique. La fonction du cil primaire reste largement inconnue. Cependant, les cils primaires ont d'importantes propriétés de transducteur sensoriel, y compris la réponse des cellules épithéliales rénales à l'écoulement de fluide ou à la stimulation mécanique. Récemment, des maladies kystiques rénales ont été associées à des protéines ciliaires dysfonctionnelles. Bien que les propriétés sensorielles des cils primaires épithéliaux rénaux puissent être associées à l'activité des canaux fonctionnels dans l'organite, les informations à cet égard font encore défaut. Cela peut être lié aux difficultés inhérentes à l'évaluation de l'activité électrique dans cet organite plutôt petit et étroit. Dans la présente étude, nous fournissons la première preuve électrophysiologique directe de la présence de courants à canal unique à partir de cils primaires isolés de cellules épithéliales rénales LLC-PK1. Plusieurs phénotypes de canaux ont été observés, et l'ajout de vasopressine a augmenté l'activité des canaux cationiques, ce qui suggère la régulation, par la voie de l'AMPc de la conductance ciliaire. La reconstitution des canaux ioniques des membranes ciliaires par rapport aux membranes plasmiques a indiqué une densité de canaux beaucoup plus élevée dans les cils. Au moins trois protéines de canal, la polycystine-2, TRPC1 et, fait intéressant, le canal sodique α-épithélial, ont été immunodétectées dans cet organite. L'activité des canaux ioniques dans le cil primaire des cellules rénales peut être un élément important de son rôle de transducteur sensoriel. Le cil primaire est un organite omniprésent et non mobile dépourvu de la paire centrale de microtubules présents dans les cils mobiles (1Bray D. Mouvements cellulaires. Garland Publishing Inc., New York et Londres1992: 265-294Google Scholar, 2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. Opin. Cell Biol. 2003 ; 15: 105-110Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar). Des études récentes indiquent que les cils primaires des cellules épithéliales rénales peuvent avoir des propriétés sensorielles importantes (3Schwartz e.a. Leonard M.L. Bizios R. Bowser S.S. Am. J. Physiol. 1997 ; 272 : F132-F138PubMed Google Scholar). La flexion des cils primaires soit par écoulement de fluide soit par stimulation mécanique initie un influx extracellulaire de Ca2+ amplifié par la libération de Ca2+ des réserves intracellulaires (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001 ; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar). Kystique rénal (5Morgan D. Turnpenny L. Goodship J. Dai W. Majumder K. Matthews L. Gardner A. Schuster G. Vien L. Harrison W. Elder F.F. Penman-Splitt M. Overbeek P. Strachan T. Nat. Genet. 1998 ; 20: 149-156Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar, 6Yoder B.K. Tousson A. Millican L. Wu J. Bugg Jr, C.E. J.A. Schafer D.F. Balkovetz Am. J. Physiol. 2002 ; 282 : F541-F552Crossref PubMed Scopus (204) Google Scholar, 7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002 ; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 8Hou X. Mrug M. Yoder B.K. Lefkowitz E.J. Kremmidiotis G. D'Eustachio P. Beier D.R. Guay-Woodford L.M. J. Clin. Investig. 2002 ; 109: 533-540Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar, 9Pazour G.J. San Agustin J.T. Follit J.A. Rosenbaum J.L. Witman G.B. Curr. Biol. 2002 ; 12 : R378-R380Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar) et d'autres maladies (10Afzelius B.A. J. Pathol. 2004 ; 204: 470-477Crossref PubMed Scopus (279) Google Scholar) ont récemment été associés à des protéines ciliaires dysfonctionnelles. Bien que la fonction sensorielle par les cils primaires épithéliaux rénaux puisse impliquer une activité fonctionnelle des canaux dans l'organite, les informations à cet égard manquent encore complètement (2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. Opin. Cell Biol. 2003 ; 15: 105-110Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar, 11Praetorius H.A. Spring K.H. Annu. Rev. Physiol. 2005 ; 67: 515-529Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). À l'exception des cils nodaux, qui présentent un mouvement tourbillonnaire inhabituel (12Nonaka S. Tanaka Y. Okada Y. Takeda S. Harada A. Kanai Y. Kido M. Hirokawa N. Cell. 1998 ; 95: 829-837Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1225) Google Scholar), on pense que les cils primaires ne sont pas mobiles en raison du manque de dynéines axonémiques. Les cils primaires, comme tous les cils et flagelles eucaryotes, sont entourés d'une membrane continue avec la membrane plasmique avec un complément unique de protéines membranaires telles que les récepteurs (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann-Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999 ; 89: 909-926Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar, 14Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000 ; 872: 271-275Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar) et des protéines de canal telles que la polycystine (PC) 5Les abréviations utilisées sont : PC, polycystine ; TRP, potentiel de récepteur transitoire, TRPC1, TRP-canonical 1 ; TRPP2, TRP-polycystine-2 ; pS, picosiemens. 5Les abréviations utilisées sont : PC, polycystine ; TRP, potentiel de récepteur transitoire, TRPC1, TRP-canonique 1 ; TRPP2, TRP-polycystine-2 ; pS, picosiemens.-2 (7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002 ; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003 ; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). La fonction de cet organite est encore largement inconnue. Plusieurs hypothèses ont été soulevées quant au (x) rôle(s) potentiel (s) du cil primaire dans la fonction cellulaire, allant de l'appendice vestigial sans fonction apparente, à un rôle potentiellement pertinent dans le cycle cellulaire, tel qu'il est dérivé du centriole (2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. Opin. Cell Biol. 2003 ; 15: 105-110Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar). Les cils primaires proviennent des centrioles qui organisent le fuseau mitotique (16Rieder C.L. Jensen C.G. Jensen L.C. J. Ultrastruct. Res. 1979 ; 68: 173-185Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar), et leur expression dépend fortement du cycle cellulaire. Les cils sont plus abondants dans les cellules G0 non proliférantes et peuvent souvent être trouvés dans les cellules pendant l'interphase. Cilia s'assemble en G1 jusqu'à ce que la formation de la broche soit initiée par la séparation du centriole (16Rieder C.L. Jensen C.G. Jensen L.C. J. Ultrastruct. Res. 1979 ; 68: 173-185Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar). Les cils primaires rénaux s'étendent à plusieurs micromètres de leur surface apicale (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001 ; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 17Wheatley D.N. Bowser S.S. Biol. Cell. 2000 ; 92: 573-582Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). Un rôle mécano-sensoriel des cils primaires rénaux a été récemment impliqué dans l'activation cellulaire. Il a récemment été démontré que la flexion des cils primaires des cellules rénales cultivées par écoulement de fluide ou stimulation mécanique déclenche un afflux extracellulaire de Ca2+, qui est amplifié par la libération de Ca2+ des réserves intracellulaires (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001 ; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 18Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2003 ; 191: 69-76Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar). Fait intéressant, le complexe du canal PC1·PC2 n'est pas seulement présent dans les cils primaires des cellules épithéliales rénales (7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002 ; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003 ; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar) mais peut être une exigence pour la signalisation Ca2+ et l'activation cellulaire ultérieure (15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003 ; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). Il est donc supposé que les signaux d'afflux de Ca2+ initiés par la transduction ciliaire peuvent être l'étape initiale de l'activation cellulaire, y compris la réplication et la différenciation cellulaires. La façon dont cet organite long et étroit se comporte comme un transducteur de signal est encore inconnue. Des études antérieures sur les cils sensoriels indiqueraient cependant que l'activité des canaux dans les membranes ciliaires peut être un facteur important de sa fonction sensorielle (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990 ; 57: 1091-1094Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (31) Google Scholar). Dans ce rapport, nous fournissons la première preuve directe de la présence de divers phénotypes de canaux dans les cils primaires non mobiles des cellules épithéliales rénales LLC-PK1. La densité du canal ciliaire est beaucoup plus élevée que l'activité du canal membranaire plasmique, suggérant un phénomène électrique, où la dépolarisation de cet organite, par rapport au cytoplasme, peut contribuer à sa fonction sensorielle. Isolement de Cilia à partir de cellules LLC-PK1 - Les cellules LLC-PK1 de type sauvage ont été cultivées dans le milieu modifié Eagle's de Dulbecco supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, comme indiqué (20Raychowdhury M.K. Ibarra C. Damiano A. Jackson Jr, G.R. Smith G.R. McLaughlin P.R. Prat A.G. Ausiello D.A. Lader A.S. Cantiello H.F. J. Biol. Chem. 2004 ; 279: 20137-20146Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar). Les cils primaires des cellules LLC-PK1 ont été isolés comme suit. Les monocouches confluentes (2-3 semaines) ont été raclées avec une solution saline tamponnée au phosphate sans Ca2+ et centrifugées pendant 5 min à 52 × g. Le culot cellulaire a été mis en suspension dans une solution à forte « déciliation » de Ca2+ contenant 112 mm NaCl, 3,4 mm KCl, 10 mm CaCl2, 2,4 mm NaHCO3, 2 mm HEPES, pH 7,0. Les cellules remises en suspension ont été agitées dans cette solution pendant 10 min à 4 °C. Les membranes ciliaires ont été séparées par centrifugation à 7 700 × g pendant 5 min. Le surnageant a été chargé sur une solution de saccharose à 45% dans une solution saline riche en Ca2+ et centrifugé pendant 1 h à 100 000 × g. La bande d'interface saccharose-supernatant a été recueillie et diluée (1:10) et centrifugée à nouveau pendant 1 h à 100 000 × g. Le culot a été remis en suspension dans une solution saline normale, pH 7,0, et complété avec 2,0 mm d'EGTA et 0,5 mm de saccharose. Les échantillons ont été aliquotés et conservés à -80 °C jusqu'à leur utilisation ultérieure. Des membranes plasmatiques de cellules LLC-PK1 confluentes ont été obtenues comme indiqué (20Raychowdhury M.K. Ibarra C. Damiano A. Jackson Jr, G.R. Smith G.R. McLaughlin P.R. Prat A.G. Ausiello D.A. Lader A.S. Cantiello H.F. J. Biol. Chem. 2004 ; 279: 20137-20146Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar). Une teneur en protéines 50 fois plus élevée dans les membranes plasmiques par rapport aux cils isolés (1160 ± 190 μg/ml contre 15,8 ± 4,64 μg/ml, p < 0,004, n = 3) a été observée par la méthode de Lowry. Immunochimie - Les cellules confluentes ont été fixées avec du paraformaldéhyde (4%) et 2% de saccharose, pendant 10 min. Les cellules ont été rincées trois fois avec une solution tampon phosphate et perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 ou 1 % de Nonidet P-40. Certaines cellules ont été immunomarquées sans perméabilisation. Les cellules ont été bloquées avec 1% d'albumine sérique bovine ou Image-it (MP) pendant 30 minutes avant l'exposition à l'anticorps primaire. Les cellules ont été immunomarquées avec un anticorps anti-tubuline α acétylée (AcM, Sigma) à des concentrations de 2,8 μg/ml de solution mère. L'anticorps polyclonal anti-PC2 (0,2 mg/ml stock) a été obtenu auprès de PolyFast™ (Zymed Laboratories Inc.). L'anticorps TRPC1 (dilution 1:200 à partir d'un stock de 0,3 mg/ml, Sigma) provient de lapin contre un peptide correspondant aux acides aminés 557-571 du TRPC1 humain. L'anticorps anti- canal sodique α-épithélial du rat était un cadeau aimable du Dr Tom Kleyman. Un anticorps Alexa Fluor 594 secondaire de chèvre anti- lapin (Molecular Probes) a été utilisé à 2 μg/ml. Microscopie électronique - Les cils isolés ont été fixés dans une solution contenant 2% de glutaraldéhyde et de cacodylate de Na+. Les échantillons étaient avec le tampon, filés à 90 000 × g dans une ultracentrifugeuse TL 100 pendant 1 h à 4 °C. Le culot a été coloré pendant 2 h à température ambiante avec 2% d'OsO4. Inversement, des aliquotes (10 μl) ont été placées sur une grille dorée, éliminées avec du papier Whatman (#5) et colorées négativement pendant 10 s avec de l'acide phosphotungstique à 2%. Les échantillons ont été observés avec un microscope électronique Phillips CM10 à 80 kV. L'électrophysiologie des plaques isolées attachées à Cilia-Cilium a été obtenue à partir de cils isolés. Les courants et les tensions de commande ont été obtenus avec un amplificateur de patch clamp Dagan 3900 (Dagan Corp.) en configuration de clamp de tension avec des ajustements de soustraction de fuite. La reconstitution des canaux ioniques des membranes ciliaires a été effectuée comme indiqué pour d'autres membranes (21González-Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris p.c. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello H.F. Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001 ; 98: 1182-1187Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar) avec quelques modifications. Brièvement, les cils isolés ont été mélangés et soniqués dans le mélange lipidique (21González-Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris p.c. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello H.F. Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001 ; 98: 1182-1187Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar) avant reconstitution dans un système bicouche lipidique. Tous les signaux électriques ont été filtrés à 5 kHz avec le filtre de Bessel à quatre pôles interne (Dagan Corp.). Les données ont d'abord été analysées avec PClamp 6.0.3 (Axon Instruments), et la ligne de base des enregistrements actuels a été corrigée manuellement avec Clampfit 8.0. La pipette à patch a été remplie d'une solution contenant 140 mm de NaCl, 5,0 mm de KCl, 1,0 mm de MgCl2, 2,5 mm de CaCl2 et 10 mm d'HEPES, ajustée à pH 7,4 avec de la N-méthylglucamine. La solution de bain contenait une solution identique, et chaque fois qu'elle était indiquée, elle était remplacée par une solution contenant 145 mm de KCl, 1,0 mm de MgCl2, 2,5 mm de CaCl2 et 10 mm d'HEPES, ajustée à pH 7,4 avec de la N-méthylglucamine. L'EGTA a été ajouté à partir d'une solution mère de 100 mm. Les patchs étaient intrinsèquement perméables, ce qui limite leurs analyses (22Stühmer W. Roberts W.S. Almers W. Sakmann B. Neher E. Single Channel Recording. Plenum Press, New York1983: 123-132Google Scholar, 23Roberts W.M. Almers W. Rudy B. Iverson L.E. Ion Channels. 207. Academic Press Inc., New York1992: 155-176Google Scholar). Ainsi, les restrictions suivantes s'appliquent aux données. Les enregistrements actuels n'ont été obtenus que sous un ensemble donné de solutions, après compensation du potentiel de pointe à « courant nul » en l'absence de soustraction de fuite. Cette procédure a été répétée chaque fois qu'une solution a été changée. Les changements dans les courants de base après les procédures expérimentales ont empêché la quantification. Ainsi, seule l'identification des niveaux de canal a été jugée pertinente. Identification et isolement des cils primaires à partir des cellules LLC-PK1 - L'expression des cils primaires dans les cellules LLC-PK1 a été déterminée par marquage immunocytochimique de la tubuline acétylée, plus particulièrement dans les dômes remplis de liquide et les kystes spontanément formés (Fig. 1a). La plupart des cellules contenaient des cils identifiables comme un bourgeon épais proéminent et/ou des structures plus allongées à tous les stades de la croissance. Des cils primaires ont été détectés dans les cellules tapissant la paroi des dômes de transport (Fig. 1b). Un examen plus attentif de la localisation cellulaire a indiqué un développement clair vers le côté du noyau (Fig. 1c). Certains cils s'étendaient à plusieurs micromètres de la membrane apicale, qui avait le motif fragmenté distinctif de la tubuline acétylée (Fig. 1d). Les cils primaires des cellules confluentes LLC-PK1 ont été isolés avec une technique adaptée des rapports précédents (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995 ; 269 : C1235-C1244Crossref PubMed Google Scholar, 25Delgado R. Saavedra M.V. Schmachtenberg O. Sierralta J. Bacigalupo J. J. Neurophysiol. 2003 ; 90: 2022-2028Crossref PubMed Scopus (27) Google Scholar). Brièvement, les cellules LLC-PK1 confluentes ont été déciliées par une exposition rapide à une solution à haute teneur en Ca2+ et concentrées dans un gradient de densité de saccharose. Des cils isolés ont été identifiés après fixation et immunomarquage avec un anticorps anti-tubuline acétylée (Fig. 2a). Les cils isolés ont été davantage visualisés et identifiés à une résolution plus élevée (×25 000) par microscopie électronique (Fig. 2b) où les tiges et les pointes ciliaires peuvent être identifiées comme indiqué (26Mitchell K.A.P. Gallagher B.C. Szabo G. Otero A.d. S. Cell Motil. Cytoskeleton. 2004 ; 59: 62-73Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar).FIGURE 2Approche expérimentale pour acquérir des informations électriques à partir de cils primaires. a, des cils primaires isolés à partir de cellules épithéliales rénales LLC-PK1 ont été obtenus avec une procédure de déciliation cellulaire décrite dans « Procédures expérimentales.« Les cils isolés ont été visualisés par immunocytochimie à un grossissement ×100 après fixation et marquage avec un anticorps anti-tubuline acétylée. b, micrographie électronique des cils isolés. Les pointes de flèche et les flèches indiquent les structures des cils et de la pointe des cils, respectivement, conformément aux rapports précédents (26Mitchell K.A.P. Gallagher B.C. Szabo G. Otero A.d. S. Cell Motil. Cytoskeleton. 2004 ; 59: 62-73Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). Les panneaux de droite détaillent les cils et les pointes. c, la pipette à patch a été approchée avec un grossissement inférieur (×40), puis est passée à un grossissement supérieur (d, ×60). e, l'aspiration du cil vers la pipette à patch a augmenté la résistance de la pointe, ce qui a encore augmenté par la soustraction des fuites avec l'amplificateur de la pince à patch.Voir la grande image Visualisation de la figureTélécharger l'image haute résolution (PPT) Patch Clamping des cils isolés - Pour obtenir des informations électrophysiologiques directes, les cils isolés ont été identifiés sous contraste de phase huileuse (×100) dans une solution saline, et après l'emplacement, visualisés davantage à une résolution inférieure (×40) pour placer la pipette à patch à proximité du cil isolé (Fig. 2, c et d). La résistance de la pointe a été suivie par l'application d'impulsions carrées de 1 mV avant et après l'aspiration de la pipette patch contre le cil isolé (Fig. 2e). Le plus souvent, la résistance augmentait après le toucher, indiquant que l'aspiration sous vide était suffisante pour produire un « patch qui fuyait.Compensation « soustraction de fuite » suivie de l'amplificateur patch clamp. Malgré la « fuite » intrinsèque des patchs, l'activité du canal a été clairement observée dans des conditions spontanées (n = 22/22, Fig. 3a). Le canal ionique le plus fréquent observé (Fig. 3, a-d) avait une conductance de canal unique de 83,6 ± 1,0 pS (n = 3) dans du NaCl symétrique. Le remplacement de la solution de bain par du Na+-aspartate (71,5 ± 1,47 pS, Fig. 3d) ou du KCl (73,2 ± 1,58 pS, Fig. 3d) n'a pas largement modifié la conductance unique, le potentiel d'inversion ou les propriétés de rectification, suggérant son activité en tant que canal cationique non sélectif. Un autre phénotype de canal cationique non sélectif avec une conductance de canal unique de 173 ± 4,40 pS (n = 3) a été observé dans le cil primaire (Fig. 3d, encart). On ignore actuellement si ce phénotype de canal représente un « dimère » du canal 83-pS. De plus, un petit canal perméable au Na+ (8,07 ± 0,50 pS, n = 3) a également été observé après l'ajout d'AVP (10 μm, Fig. 3, e et f). La présence de récepteurs de la vasopressine V2R est actuellement à l'étude et suggérerait qu'une deuxième voie messagère locale est présente dans les cils primaires isolés (à signaler ailleurs). Fait intéressant, l'ajout de protéine kinase dépendante de l'AMPc (50 nm) et de MgATP (3-6 mm) a également augmenté l'activité des canaux cationiques (Fig. 3g). Cela suggère que la vasopressine agit sur une réponse de type V2R, au lieu d'une réponse de type V1R. Cependant, nous ne savons pas actuellement comment l'enzyme atteint le compartiment intraciliaire. Il est probable, cependant, que la nature perméable et ouverte du cil isolé aide à diffuser les médicaments en place. La fonction des canaux a été inhibée par l'ajout d'amiloride (5 μm, n = 4, Fig. 3h). La reconstitution des canaux membranaires ciliaires isolés a également été observée par reconstitution dans un système bicouche lipidique (Fig. 3, i et j) en présence d'un gradient de Na+ (150 contre 15 mm, dans les compartiments cis et trans, respectivement). Des canaux ont été observés dans 297 des 303 membranes ciliaires. Le canal sélectif des cations le plus fréquent avait une conductance de canal unique de 156 pS, qui était inhibée par un anticorps anti-PC2 (Fig. 3i). Les membranes ciliaires reconstituées présentaient rarement des canaux perméables au Cl 75-pS (3/303, Fig. 3j), ce qui explique pourquoi il n'a pas été observé dans les patchs fixés au cil. Les données indiquent cependant qu'une activité abondante des canaux perméables aux cations est présente dans les membranes ciliaires. Une comparaison des membranes ciliaires reconstituées par rapport aux membranes plasmiques a indiqué une activité des canaux 400 fois plus élevée dans les membranes ciliaires que les courants moyens moyens moyens ont été divisés par la teneur en protéines (Fig. 3k). Présence de protéines du canal dans le cil primaire - Pour commencer l'identification des protéines du canal contribuant à l'activité électrique du cil primaire dans les cellules épithéliales rénales, l'immunolocalisation a été réalisée dans des cils isolés identifiés par co-marquage avec de la tubuline acétylée. Plusieurs canaux ioniques ont été identifiés dans les cils primaires. Les canaux de type TRP TRPC1 et polycystine-2 (TRPP2) ont été immunodétectées dans les cils primaires des cellules LLC-PK1 confluentes (Fig. 4) et également des cils isolés (données non présentées). Fait intéressant, la sous-unité du canal Na+ épithélial α-canal sodique épithélial a également été observée sur toute la surface du cil primaire (Fig. 4b). La présence de plusieurs espèces de canaux est en accord avec la forte perméabilité électrodifussionnelle observée dans le cil primaire, par rapport à la membrane plasmique. Des preuves récentes indiquent que les cellules épithéliales rénales peuvent détecter les forces environnementales par l'activité mécano-sensorielle du cil primaire (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001 ; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003 ; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). On sait cependant peu de choses sur les mécanismes moléculaires associés à la fonction sensorielle des cils primaires rénaux. L'activité électrique dans cet organite, médiée par les canaux ioniques fonctionnels, peut être un contributeur important à cette fonction sensorielle. Parmi les membranes ciliaires les plus étudiées figurent celles des neurones sensoriels du bulbe olfactif (27Labarca P. Bacigalupo J. J. Bioenerg. Biomembr. 1988 ; 20: 551-569Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar, 28Frings S. Lindemann B. J. Gen. Physiol. 1991 ; 97: 1-16Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 29Nakamura T. Lee H.H. Kobayashi H. Satoh T.O. Biophys. J. 1996 ; 70: 813-817Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (22) Google Scholar, 30Murphy G.J. Isaacson J.S. Neuron. 2003 ; 37: 639-647Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar) et cils sensoriels d'invertébrés ciliés (31Fujiwara C. Anzai K. Kirino Y. Nagao S. Nozawa Y. Takahashi M. J. Biochem. (Tokyo). 1988 ; 104: 344-348Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar, 32Fujiwara-Hirashima C. Anzai K. Takahashi M. Kirino Y. Biochim. Biophys. Acta. 1996 ; 1280: 207-216Crossref PubMed Scopus (7) Google Scholar). La reconstitution des membranes ciliaires olfactives dans les bicouches lipidiques planes a été réalisée à l'origine par Ehrlich et al. (33Ehrlich B.E. Finkelstein A. Forte M. Kung C. Science. 1984 ; 225: 427-428Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar) a démontré la présence de canaux Ca2+ voltage-dépendants de Paramecium cilia. La reconstitution des membranes ciliaires à partir de Tetrahymena thermophila de type sauvage et mutant a également montré la présence d'autres canaux cationiques (31Fujiwara C. Anzai K. Kirino Y. Nagao S. Nozawa Y. Takahashi M. J. Biochem. (Tokyo). 1988 ; 104: 344-348Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar, 34Oosawa Y. Sokabe M. Kasai M. Cell Struct. Funct. 1988 ; 13: 51-60Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar). Les membranes ciliaires sensorielles reconstituées ont également permis d'identifier les mécanismes de signalisation impliqués dans la régulation des canaux ciliaires. Labarca et al. (35Labarca P. Simon S.A. Anholt R.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988 ; 85: 944-947Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar) a observé que les canaux ioniques des membranes ciliaires reconstituées de l'épithélium olfactif de Rana catesbeiana sont sensibles aux concentrations nanomolaires de ligands odorants. Cela a peut-être été l'une des premières démonstrations de canaux fonctionnels de type récepteur vanilloïde TRP dans les cils. L'AMP cyclique a activé les canaux cationiques 23-pS dans les cils olfactifs des vertébrés (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995 ; 269 : C1235-C1244Crossref PubMed Google Scholar) et a modulé un canal K+ à haute conductance, affichant plusieurs sous-états ouverts avec des conductances de 34, 80 et 130 pS (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995 ; 269 : C1235-C1244Crossref PubMed Google Scholar), qui rappelle fortement la fonction PC2 (21González-Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris p.c. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello H.F. Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001 ; 98: 1182-1187Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar). La présence de canaux chlorure de 8 pS activés par l'AMPc a également été déterminée par l'analyse du bruit à l'état d'équilibre des courants induits par les ligands (36Larsson H.P. Kleene S.J. Lecar H. Biophys. J. 1997 ; 72: 1193-1203Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (47) Google Scholar). Les membranes des cils sensoriels contiennent également des canaux inositol 3-phosphate-dépendants (37Honda E. Teeter J.H. Restrepo D. Brain Res. 1995 ; 703: 79-85Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). Dans cette étude, deux types de canaux cationiques non sélectifs ont été observés par les fluctuations actuelles des membranes ciliaires olfactives de rat fusionnées sur des bicouches phospholipidiques. Les informations électriques directes des cils sensoriels in situ ont été obtenues par Frings et Lindemann (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990 ; 57: 1091-1094Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (31) Google Scholar), qui a mené des études très exigeantes pour déterminer les propriétés biophysiques et la régulation des conductances ioniques dans les cils du bulbe olfactif de grenouille. Les auteurs ont réussi à extraire les cils sensoriels des cellules réceptrices olfactives dans une pipette à patch. Malgré le fait que la pipette ne formait pas un joint électrique étanche avec la membrane ciliaire, des courants records transitoires entraînés par des potentiels d'action provenant du neurone olfactif ont été collectés. Avec cette méthode, des seuils odorants dans la gamme picomolaire ont été obtenus (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990 ; 57: 1091-1094Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (31) Google Scholar), indiquant que l'affinité pour le ligand est beaucoup plus élevée in situ qu'avec des préparations reconstituées. Cette constatation suggère également que, même si elles sont difficiles, ces expériences peuvent fournir des informations plus fiables qui ne sont pas disponibles par d'autres méthodes (28Frings S. Lindemann B. J. Gen. Physiol. 1991 ; 97: 1-16Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 38Frings S. Benz S. Lindemann B. J. Gen. Physiol. 1991 ; 97: 725-747Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar). Les preuves englobées suggèrent une abondance de canaux ioniques dans les cils sensoriels. Plusieurs récepteurs de la protéine G, y compris ceux de la somatostatine et de la sérotonine, ont également été trouvés dans les cils primaires des neurones du cerveau (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann-Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999 ; 89: 909-926Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar, 14Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000 ; 872: 271-275Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). Ainsi, la fonction sensorielle dans les cils est intrinsèquement liée à la présence de canaux fonctionnels dans ces membranes. À ce jour, aucune information n'est disponible sur les récepteurs membranaires et/ou l'activité des canaux ioniques dans les cils primaires des cellules épithéliales rénales. Des études récentes indiquent cependant que les produits géniques autosomiques dominants de la polykystose rénale PC1 et PC2, un nouveau membre du canal TRP (TRPP2), sont présents dans les cils primaires des cellules épithéliales rénales (7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002 ; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 9Pazour G.J. San Agustin J.T. Follit J.A. Rosenbaum J.L. Witman G.B. Curr. Biol. 2002 ; 12 : R378-R380Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003 ; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). Une interaction fonctionnelle entre les deux peut sembler centrale aux événements de signalisation cellulaire environnementale conduisant à la régulation du transport de Ca2+ et à la signalisation cellulaire subséquente (15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003 ; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). Dans la présente étude, nous avons décrit une méthode pour acquérir des données à canal unique à partir de cils primaires isolés et avons fourni la première preuve directe de la présence de canaux fonctionnels dans la membrane recouvrant le cil primaire des cellules épithéliales rénales. Au moins trois phénotypes de canaux sélectifs pour les cations ont été observés, bien que le canal sélectif pour les cations ∼ 80-pS puisse être l'état de sous-conductance le plus répandu d'un grand canal tel qu'observé à la fois dans les plaques ciliaires et les membranes reconstituées. Les présentes données sont en accord avec la présence d'une activité de canal de type TRP dans les cils primaires des cellules épithéliales rénales. Une capacité à patcher et à identifier les courants à canal unique dans ces organites étroits peut probablement résider dans le fait que le processus d'isolement gonfle les cils à des dimensions où la zone de la membrane est suffisamment grande pour interagir avec la pipette de patch. Le canal cationique dans les cils primaires des cellules épithéliales rénales peut aider à maintenir ce compartiment dépolarisé par rapport au cytoplasme de la cellule, comme le montre le modèle hypothétique de la fonction ciliaire (Fig. 4c). La présence d'une réponse à l'AMPc est compatible avec la présence de la protéine α-épithéliale régulée par la protéine kinase dépendante de l'AMPc dans cet organite. Ceci est également en accord avec les données obtenues dans les cils sensoriels serrés en tension (36Larsson H.P. Kleene S.J. Lecar H. Biophys. J. 1997 ; 72: 1193-1203Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (47) Google Scholar) et la présence de récepteurs de la protéine G, tels que ceux de la somatostatine et de la sérotonine dans les cils des neurones du cerveau (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann-Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999 ; 89: 909-926Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar, 14Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000 ; 872: 271-275Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). Ainsi, une activité élevée des canaux cationiques intrinsèques dans les cils primaires non mobiles des cellules épithéliales rénales peut contribuer aux propriétés sensorielles de cet organite. Nous remercions María del Rocío Cantero, Jimena Semprine, Gustavo A. Timpanaro et le Dr Marisa Repetto pour leur excellent soutien technique. Nous sommes également reconnaissants au Dr Dennis Brown, pour la vérification critique du manuscrit et les suggestions techniques d'experts. Le Microscope Core Facility du programme MGH en biologie membranaire reçoit un soutien supplémentaire du Boston Area Diabetes and Endocrinology Research Center et du Center for the Study of Inflammatory Bowel Disease.
El cilio primario es un orgánulo microtubular ubicuo y no móvil que carece del par central de microtúbulos que se encuentran en los cilios móviles. Los cilios primarios están rodeados por una membrana, que tiene un complemento único de proteínas de membrana y, por lo tanto, pueden ser funcionalmente diferentes de la membrana plasmática. La función del cilio primario sigue siendo en gran parte desconocida. Sin embargo, los cilios primarios tienen importantes propiedades de transductor sensorial, incluida la respuesta de las células epiteliales renales al flujo de fluidos o la estimulación mecánica. Recientemente, las enfermedades quísticas renales se han asociado con proteínas ciliares disfuncionales. Aunque las propiedades sensoriales de los cilios primarios epiteliales renales pueden estar asociadas con la actividad del canal funcional en el orgánulo, todavía falta información a este respecto. Esto puede estar relacionado con las dificultades inherentes a la evaluación de la actividad eléctrica en este orgánulo bastante pequeño y estrecho. En el presente estudio, proporcionamos la primera evidencia electrofisiológica directa de la presencia de corrientes de un solo canal de cilios primarios aislados de células epiteliales renales LLC-PK1. Se observaron varios fenotipos de canales, y la adición de vasopresina aumentó la actividad de los canales catiónicos, lo que sugiere la regulación, por la vía del AMPc de la conductancia ciliar. La reconstitución del canal iónico de las membranas ciliares frente a las plasmáticas indicó una densidad de canales mucho mayor en los cilios. En este orgánulo se inmunodetectaron al menos tres proteínas de canales, policistina-2, TRPC1 y, curiosamente, el canal de sodio α-epitelial. La actividad del canal iónico en el cilio primario de las células renales puede ser un componente importante de su papel como transductor sensorial. El cilio primario es un orgánulo microtubular ubicuo y no móvil que carece del par central de microtúbulos que se encuentran en los cilios móviles. Los cilios primarios están rodeados por una membrana, que tiene un complemento único de proteínas de membrana y, por lo tanto, pueden ser funcionalmente diferentes de la membrana plasmática. La función del cilio primario sigue siendo en gran parte desconocida. Sin embargo, los cilios primarios tienen importantes propiedades de transductor sensorial, incluida la respuesta de las células epiteliales renales al flujo de fluidos o la estimulación mecánica. Recientemente, las enfermedades quísticas renales se han asociado con proteínas ciliares disfuncionales. Aunque las propiedades sensoriales de los cilios primarios epiteliales renales pueden estar asociadas con la actividad del canal funcional en el orgánulo, todavía falta información a este respecto. Esto puede estar relacionado con las dificultades inherentes a la evaluación de la actividad eléctrica en este orgánulo bastante pequeño y estrecho. En el presente estudio, proporcionamos la primera evidencia electrofisiológica directa de la presencia de corrientes de un solo canal de cilios primarios aislados de células epiteliales renales LLC-PK1. Se observaron varios fenotipos de canales, y la adición de vasopresina aumentó la actividad de los canales catiónicos, lo que sugiere la regulación, por la vía del AMPc de la conductancia ciliar. La reconstitución del canal iónico de las membranas ciliares frente a las plasmáticas indicó una densidad de canales mucho mayor en los cilios. En este orgánulo se inmunodetectaron al menos tres proteínas de canales, policistina-2, TRPC1 y, curiosamente, el canal de sodio α-epitelial. La actividad del canal iónico en el cilio primario de las células renales puede ser un componente importante de su papel como transductor sensorial. El cilio primario es un orgánulo ubicuo e inmóvil que carece del par central de microtúbulos que se encuentran en los cilios móviles (1Bray D. Cell Movements. Garland Publishing Inc., Nueva York y Londres 1992: 265-294Google Scholar, 2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. Opin. Cell Biol. 2003; 15: 105-110Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar). Estudios recientes indican que los cilios primarios de las células epiteliales renales pueden tener propiedades sensoriales importantes (3Schwartz E.A. Leonard M.L. Bizios R. Bowser S.S. Am. J. Physiol. 1997; 272: F132-F138PubMed Google Scholar). La flexión de los cilios primarios ya sea por flujo de fluido o estimulación mecánica inicia el influjo extracelular de Ca2+ amplificado por la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar). Renal cystic (5Morgan D. Turnpenny L. Goodship J. Dai W. Majumder K. Matthews L. Gardner A. Schuster G. Vien L. Harrison W. Elder F.F. Penman-Splitt M. Overbeek P. Strachan T. Nat. Genet. 1998; 20: 149-156Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar, 6Yoder B.K. Tousson A. Millican L. Wu J. Bugg Jr, C.E. J.A. Schafer D.F. Balkovetz Am. J. Physiol. 2002; 282: F541-F552Crossref PubMed Scopus (204) Google Scholar, 7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 8Hou X. Mrug M. Yoder B.K. Lefkowitz e.j. Kremmidiotis G. D'Eustachio P. Beier D.R. Guay-Woodford L.M. J. Clin. Investig. 2002; 109: 533-540Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar, 9Pazour G.J. San Agustin J.T. Follit J.A. Rosenbaum J.L. Witman G.B. Curr. Biol. 2002; 12: R378-R380Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar) y otras enfermedades (10Afzelius B.A. J. Pathol. 2004; 204: 470-477 Crossref PubMed Scopus (279) Google Scholar) se han asociado recientemente con proteínas ciliares disfuncionales. Aunque la función sensorial de los cilios primarios epiteliales renales puede implicar la actividad funcional del canal en el orgánulo, todavía falta completamente información a este respecto (2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. Opin. Cell Biol. 2003; 15: 105-110Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar, 11Praetorius H.A. Spring K.H. Annu. Rev. Physiol. 2005; 67: 515-529Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). Excepto los cilios nodales, que exhiben un movimiento de giro inusual (12Nonaka S. Tanaka Y. Okada Y. Takeda S. Harada A. Kanai Y. Kido M. Hirokawa N. Cell. 1998; 95: 829-837Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1225) Google Scholar), se cree que los cilios primarios no son móviles debido a la falta de dineínas axonémicas. Los cilios primarios, como todos los cilios y flagelos eucariotas, están rodeados por una membrana que es continua con la membrana plasmática con un complemento único de proteínas de membrana como los receptores (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann-Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999; 89: 909-926Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar, 14Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000; 872: 271-275Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar) y proteínas de canal tales como policistina (PC) 5Las abreviaturas utilizadas son: PC, policistina; TRP, potencial de receptor transitorio, TRPC1, TRP-canónico 1; TRPP2, TRP-policistina-2; pS, picosiemens. 5Las abreviaturas utilizadas son: PC, policistina; TRP, potencial receptor transitorio, TRPC1, TRP-canónico 1; TRPP2, TRP-policistina-2; pS, picosiemens.-2 (7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). La función de este orgánulo aún se desconoce en gran medida. Se han planteado varias hipótesis sobre el (los) papel(es) potencial (es) del cilio primario en la función celular, que van desde el apéndice vestigial sin función aparente, hasta un papel potencialmente relevante en el ciclo celular, ya que se deriva del centríolo (2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. Opin. Cell Biol. 2003; 15: 105-110Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar). Los cilios primarios surgen de los centriolos que organizan el huso mitótico (16Rieder C.L. Jensen C.G. Jensen L.C.J. Ultrastruct. Res. 1979; 68: 173-185Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar), y su expresión es altamente dependiente del ciclo celular. Los cilios son más abundantes en las células G0 no proliferantes y a menudo se pueden encontrar en las células durante la interfase. Los cilios se ensamblan en G1 hasta que se inicia la formación del husillo por separación de centriolos (16Rieder C.L. Jensen C.G. Jensen L.C.J. Ultrastruct. Res. 1979; 68: 173-185Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar). Los cilios primarios renales se extienden varios micrómetros desde su superficie apical (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 17Wheatley D.N. Bowser S.S. Biol. Cell. 2000; 92: 573-582Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). Recientemente se ha implicado un papel mecanosensorial de los cilios primarios renales en la activación celular. Recientemente se ha demostrado que la flexión de los cilios primarios de las células renales cultivadas por flujo de fluidos o estimulación mecánica inicia la afluencia extracelular de Ca2+, que se amplifica por la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 18Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2003; 191: 69-76Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar). Curiosamente, el complejo del canal PC1·PC2 no solo está presente en los cilios primarios de las células epiteliales renales (7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar) pero puede ser un requisito para la señalización de Ca2+ y la posterior activación celular (15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). Por lo tanto, se especula que las señales de entrada de Ca2+ iniciadas por la transducción de cilios pueden ser el paso inicial en la activación celular, incluida la replicación y diferenciación celular. Todavía se desconoce cómo se comporta este orgánulo largo y estrecho como transductor de señales. Estudios previos en cilios sensoriales, indicarían, sin embargo, que la actividad del canal en las membranas ciliares puede ser un factor importante en su función sensorial (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990; 57: 1091-1094Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (31) Google Scholar). En este informe proporcionamos la primera evidencia directa de la presencia de varios fenotipos de canales en cilios primarios inmóviles de células epiteliales renales LLC-PK1. La densidad del canal ciliar es mucho mayor que la actividad del canal de la membrana plasmática, lo que sugiere un fenómeno eléctrico, donde la despolarización de este orgánulo, con respecto al citoplasma, puede contribuir a su función sensorial. Aislamiento de cilios de células LLC-PK1: se cultivaron células LLC-PK1 de tipo silvestre en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10%, como se informó (20Raychowdhury M.K. Ibarra C. Damiano A. Jackson Jr, G.R. Smith G.R. McLaughlin P.R. Prat A.G. Ausiello D.A. Lader A.S. Cantiello H.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 20137-20146Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar). Los cilios primarios de las células LLC-PK1 se aislaron de la siguiente manera. Las monocapas confluentes (2-3 semanas) se rasparon con solución salina tamponada con fosfato libre de Ca2+ y se centrifugaron durante 5 min a 52 × g. El sedimento celular se suspendió en una solución de "decilación" con alto contenido de Ca2+ que contenía 112 mm de NaCl, 3,4 mm de KCl, 10 mm de CaCl2, 2,4 mm de NaHCO3, 2 mm de HEPES, pH 7,0. Las células resuspendidas se agitaron en esta solución durante 10 min a 4 °C. Las membranas ciliares se separaron por centrifugación a 7,700 × g durante 5 min. El sobrenadante se cargó encima de una solución de sacarosa al 45% en solución salina con alto contenido de Ca2+ y se centrifugó durante 1 h a 100.000 × g. La banda de interfaz sacarosa-sobrenadante se recogió y se diluyó (1:10) y se centrifugó de nuevo durante 1 h a 100.000 × g. El sedimento se resuspendió en solución salina normal, pH 7,0, y se complementó con EGTA 2,0 mm y sacarosa 0,5 mm. Las muestras se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. Las membranas plasmáticas de células confluentes LLC-PK1 se obtuvieron como se informó (20Raychowdhury M.K. Ibarra C. Damiano A. Jackson Jr, G.R. Smith G.R. McLaughlin P.R. Prat A.G. Ausiello D.A. Lader A.S. Cantiello H.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 20137-20146Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar). Se observó un contenido de proteína 50 veces mayor en las membranas plasmáticas en comparación con los cilios aislados (1160 ± 190 μg/ml frente a 15,8 ± 4,64 μg/ml, p < 0,004, n = 3) mediante el método de Lowry. Inmunoquímica: las células confluentes se fijaron con paraformaldehído (4%) y sacarosa al 2%, durante 10 min. Las células se enjuagaron tres veces con solución amortiguadora de fosfato y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0.1% o Nonidet P-40 al 1%. Algunas células se inmunomarcaron sin permeabilización. Las células se bloquearon con albúmina de suero bovino al 1% o Image-it (MP) durante 30 min antes de la exposición al anticuerpo primario. Las células se inmunomarcaron con anticuerpo anti-alfa-tubulina acetilada (mAb, Sigma) a concentraciones de 2.8 μg/ml de solución madre. El anticuerpo policlonal anti-PC2 (0.2 mg/ml stock) se obtuvo de PolyFast™ (Zymed Laboratories Inc.). El anticuerpo TRPC1 (dilución 1:200 a partir de 0,3 mg/ml de solución madre, Sigma) es de conejo contra un péptido correspondiente a los aminoácidos 557-571 del TRPC1 humano. El anticuerpo anti-canal de sodio α-epitelial de rata fue un amable regalo del Dr. Tom Kleyman. Se utilizó un anticuerpo secundario de cabra anti-conejo Alexa Fluor 594 (Molecular Probes) a 2 μg/ml. Los cilios aislados por microscopía electrónica se fijaron en una solución que contenía glutaraldehído al 2% y cacodilato de Na+. Las muestras se mezclaron con el amortiguador, se centrifugaron a 90.000 × g en una ultracentrífuga TL 100 durante 1 h a 4 °C. El sedimento se tiñó durante 2 h a temperatura ambiente con OsO4 al 2%. Por el contrario, se colocaron alícuotas (10 μl) en una rejilla de oro, se eliminaron con papel Whatman (#5) y se tiñeron negativamente durante 10 s con ácido fosfotúngstico al 2%. Las muestras se observaron con un microscopio electrónico Phillips CM10 a 80 kV. Electrofisiología de cilios aislados: los parches unidos a cilios se obtuvieron de cilios aislados. Las corrientes y los voltajes de comando se obtuvieron con un amplificador de patch clamp Dagan 3900 (Dagan Corp.) bajo configuración de pinza de voltaje con ajustes de sustracción de fugas. La reconstitución del canal iónico de las membranas ciliares se realizó como se informó para otras membranas (21González-Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris P.C. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello H.F. Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 1182-1187Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar) con algunas modificaciones. En resumen, los cilios aislados se mezclaron y sonicaron en la mezcla de lípidos (21González-Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris P.C. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello H.F. Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 1182-1187Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar) antes de la reconstitución en un sistema de bicapa lipídica. Todas las señales eléctricas se filtraron a 5 kHz con el filtro interno de cuatro polos Bessel (Dagan Corp.). Los datos se analizaron primero con PClamp 6.0.3 (Axon Instruments), y la línea basal de los registros actuales se corrigió manualmente con Clampfit 8.0. La pipeta de parche se llenó con una solución que contenía NaCl 140 mm, KCl 5,0 mm, MgCl2 1,0 mm, CaCl2 2,5 mm y HEPES 10 mm, ajustada a pH 7,4 con N-metilglucamina. La solución de baño contenía una solución idéntica y, cuando se indicó, se reemplazó con una solución que contenía 145 mm de KCl, 1,0 mm de MgCl2, 2,5 mm de CaCl2 y 10 mm de HEPES, ajustada a pH 7,4 con N-metilglucamina. Se añadió EGTA a partir de una solución madre de 100 mm. Los parches tenían fugas intrínsecas, lo que limita sus análisis (22Stühmer W. Roberts W.S. Almers W. Sakmann B. Neher E. Single Channel Recording. Plenum Press, Nueva York 1983: 123-132Google Scholar, 23Roberts W.M. Almers W. Rudy B. Iverson L.E. Ion Channels. 207. Academic Press Inc., Nueva York1992: 155-176Google Scholar). Por lo tanto, las siguientes restricciones se aplican a los datos. Los registros actuales solo se obtuvieron bajo un conjunto dado de soluciones, después de compensar el potencial de la punta a "corriente cero" en ausencia de sustracción de fugas. Este procedimiento se repitió cada vez que se cambió una solución. Los cambios en las corrientes de referencia después de los procedimientos experimentales impidieron la cuantificación. Por lo tanto, solo se consideró relevante la identificación de los niveles de canal. Identificación y aislamiento de cilios primarios de células LLC-PK1: la expresión de cilios primarios en células LLC-PK1 se determinó mediante marcaje inmunocitoquímico con tubulina acetilada, más particularmente en domos llenos de líquido y quistes formados espontáneamente (Fig. 1a). La mayoría de las células contenían cilios identificables como un brote grueso prominente y/o estructuras más alargadas en todas las etapas de crecimiento. Se detectaron cilios primarios en las células que recubren la pared de los domos de transporte (Fig. 1b). Una mirada más cercana a la localización celular indicó un claro desarrollo hacia el lado del núcleo (Fig. 1c). Algunos cilios se extendían varios micrómetros desde la membrana apical, que tenía el patrón fragmentado distintivo de la tubulina acetilada (Fig. 1d). Se aislaron cilios primarios de células confluentes LLC-PK1 con una técnica adaptada de informes anteriores (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995; 269: C1235-C1244Crossref PubMed Google Scholar, 25Delgado R. Saavedra M.V. Schmachtenberg O. Sierralta J. Bacigalupo J. J. Neurophysiol. 2003; 90: 2022-2028 Crossref PubMed Scopus (27) Google Scholar). En resumen, las células LLC-PK1 confluentes se decilaron mediante una exposición rápida a una solución alta de Ca2+ y se concentraron en un gradiente de densidad de sacarosa. Los cilios aislados se identificaron después de la fijación e inmunomarcaje con anticuerpo anti-tubulina acetilada (Fig. 2a). Los cilios aislados se visualizaron e identificaron a mayor resolución (×25,000) mediante microscopía electrónica (Fig. 2b) donde los tallos y puntas ciliares se pueden identificar como se informó (26Mitchell K.A.P. Gallagher B.C. Szabo G. Otero A.d. S. Cell Motil. Cytoskeleton. 2004; 59: 62-73Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar) .Figura 2Enfoque experimental para adquirir información eléctrica de cilios primarios. a, se obtuvieron cilios primarios aislados de células epiteliales renales LLC-PK1 con un procedimiento de decilación celular como se describe en "Procedimientos experimentales." Los cilios aislados se visualizaron mediante inmunocitoquímica a ×100 aumentos después de la fijación y el marcaje con anticuerpo anti-tubulina acetilada. b, micrografía electrónica de cilios aislados. Las puntas de flecha y las flechas indican cilios y estructuras de punta de cilios, respectivamente, consistentes con informes anteriores (26Mitchell K.A.P. Gallagher B.C. Szabo G. Otero A.d. S. Cell Motil. Cytoskeleton. 2004; 59: 62-73Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). Los paneles derechos detallan los cilios y las puntas. c, la pipeta de parche se acercó con un aumento más bajo (×40) y luego se cambió a un aumento más alto (d, ×60). e, la succión del cilio a la pipeta de parche aumentó la resistencia de la punta, que aumentó aún más mediante la sustracción de fugas con el amplificador de pinza de parche.Ver Visor de imágenes grandesDescargar imagen de alta resolución Descargar (PPT) Pinza de parche de cilios aislados-Para obtener información electrofisiológica directa, se identificaron cilios aislados bajo contraste de fase oleosa (×100) en solución salina, y después de la ubicación, se visualizó aún más a una resolución más baja (×40) para colocar la pipeta de parche en la proximidad del cilio aislado (Fig. 2, c y d). La resistencia de la punta fue seguida por la aplicación de pulsos cuadrados de 1 mV antes y después de la succión de la pipeta de parche contra el cilio aislado (Fig. 2e). Con mayor frecuencia, la resistencia aumentó después del contacto, lo que indica que la succión al vacío fue suficiente para producir un "parche con fugas".La compensación de "sustracción de fugas" siguió con el amplificador de patch clamp. A pesar de la "fuga" intrínseca de los parches, la actividad del canal se observó claramente en condiciones espontáneas (n = 22/22, Fig. 3a). El canal iónico más frecuente observado (Fig. 3, a-d) tuvo una conductancia de un solo canal de 83.6 ± 1.0 pS (n = 3) en NaCl simétrico. El reemplazo de la solución de baño con Na+-aspartato (71.5 ± 1.47 pS, Fig. 3d) o KCl (73.2 ± 1.58 pS, Fig. 3d) no modificó en gran medida la conductancia única, el potencial de inversión o las propiedades de rectificación, lo que sugiere su actividad como un canal catiónico no selectivo. Se observó otro fenotipo de canal catiónico no selectivo con una conductancia de canal único de 173 ± 4.40 pS (n = 3) en el cilio primario (Fig. 3d, recuadro). Actualmente se desconoce si este fenotipo de canal representa un "dímero" del canal 83-pS. Además, también se observó un pequeño canal permeable al Na+ (8.07 ± 0.50 pS, n = 3) después de la adición de AVP (10 μm, Fig. 3, e y f). La presencia de receptores de vasopresina V2R se está explorando actualmente y sugeriría que una vía local de segundo mensajero está presente en los cilios primarios aislados (para informar en otro lugar). Curiosamente, la adición de proteína quinasa dependiente de cAMP (50 nm) y MgATP (3-6 mm) también aumentó la actividad del canal catiónico (Fig. 3g). Esto sugiere que la vasopresina actúa sobre un V2R, en lugar de una respuesta de tipo V1R. Sin embargo, actualmente no sabemos cómo llega la enzima al compartimento intraciliar. Sin embargo, es probable que tanto la naturaleza permeable como la abierta del cilio aislado ayuden a difundir los medicamentos en su lugar. La función del canal se inhibió mediante la adición de amilorida (5 μm, n = 4, Fig. 3h). También se observó la reconstitución de canales de membrana ciliar-Cilia aislados mediante reconstitución en un sistema de bicapa lipídica (Fig. 3, i y j) en presencia de un gradiente de Na+ (150 frente a 15 mm, en compartimento cis y trans, respectivamente). Se observaron canales en 297 de 303 membranas ciliares. El canal selectivo de cationes más frecuente tenía una conductancia de un solo canal de 156 pS, que fue inhibida por un anticuerpo anti-PC2 (Fig. 3i). Las membranas ciliares reconstituidas rara vez mostraron canales permeables al Cl 75-pS (3/303, Fig. 3j), lo que explica por qué no se observó en los parches unidos al cilio. Los datos indican, sin embargo, que la abundante actividad del canal permeable a los cationes está presente en las membranas ciliares. Una comparación de las membranas ciliares reconstituidas frente a las plasmáticas indicó una actividad del canal hasta 400 veces mayor en las membranas ciliares, ya que las corrientes medias promedio se dividieron por el contenido de proteínas (Fig. 3k). Presencia de proteínas del canal en el cilio primario: para comenzar una identificación de las proteínas del canal que contribuyen a la actividad eléctrica del cilio primario en las células epiteliales renales, se realizó la inmunolocalización en cilios aislados identificados mediante coetiquetado con tubulina acetilada. Se identificaron varios canales iónicos en los cilios primarios. Los canales de tipo TRP TRPC1 y policistina-2 (TRPP2) se inmunodetectaron en los cilios primarios de células LLC-PK1 confluentes (Fig. 4) y también en cilios aislados (datos no mostrados). Curiosamente, también se observó el canal de sodio epitelial α-epitelial de la subunidad del canal de Na+ epitelial que recubre toda la superficie del cilio primario (Fig. 4b). La presencia de varias especies de canales está de acuerdo con la alta permeabilidad electrodifusional observada en el cilio primario, con respecto a la membrana plasmática. La evidencia reciente indica que las células epiteliales renales pueden sentir las fuerzas ambientales por la actividad mecanosensorial del cilio primario (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos moleculares asociados con la función sensorial de los cilios primarios renales. La actividad eléctrica en este orgánulo, mediada por canales iónicos funcionales, puede ser un importante contribuyente a esta función sensorial. Entre las membranas ciliares más estudiadas se encuentran las de las neuronas sensoriales del bulbo olfatorio (27Labarca P. Bacigalupo J. J. Bioenerg. Biomembr. 1988; 20: 551-569Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar, 28Frings S. Lindemann B. J. Gen. Physiol. 1991; 97: 1-16Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 29Nakamura T. Lee H.H. Kobayashi H. Satoh T.O. Biophys. J. 1996; 70: 813-817Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (22) Google Scholar, 30 Murphy G.J. Isaacson J.S. Neuron. 2003; 37: 639-647Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar) y cilios sensoriales de invertebrados ciliados (31Fujiwara C. Anzai K. Kirino Y. Nagao S. Nozawa Y. Takahashi M. J. Biochem. (Tokio). 1988; 104: 344-348Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar, 32Fujiwara-Hirashima C. Anzai K. Takahashi M. Kirino Y. Biochim. Biophys. Acta. 1996; 1280: 207-216Crossref PubMed Scopus (7) Google Scholar). La reconstitución de las membranas ciliares olfativas en bicapas lipídicas planas realizada originalmente por Ehrlich et al. (33Ehrlich B.E. Finkelstein A. Forte M. Kung C. Science. 1984; 225: 427-428 Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar) demostraron la presencia de canales de Ca2+ dependientes de voltaje de cilios de Paramecium. La reconstitución de membranas ciliares de Tetrahymena thermophila de tipo salvaje y mutante también mostró la presencia de otros canales catiónicos (31Fujiwara C. Anzai K. Kirino Y. Nagao S. Nozawa Y. Takahashi M. J. Biochem. (Tokio). 1988; 104: 344-348Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar, 34Oosawa Y. Sokabe M. Kasai M. Cell Struct. Funct. 1988; 13: 51-60Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar). Las membranas ciliares sensoriales reconstituidas también han permitido identificar los mecanismos de señalización involucrados en la regulación del canal ciliar. Labarca et al. (35Labarca P. Simon S.A. Anholt R.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988; 85: 944-947Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar) observaron que los canales iónicos de las membranas ciliares reconstituidas del epitelio olfativo de Rana catesbeiana son sensibles a concentraciones nanomolares de ligandos odorantes. Esta puede haber sido una de las primeras demostraciones de canales funcionales de tipo receptor vanilloide de TRP en los cilios. El AMP cíclico activó los canales catiónicos 23-pS en cilios olfativos de vertebrados (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995; 269: C1235-C1244Crossref PubMed Google Scholar) y moduló un canal K+ de alta conductancia, mostrando varios subestados abiertos con conductancias de 34, 80 y 130 pS (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995; 269: C1235-C1244Crossref PubMed Google Scholar), que recuerda mucho a la función PC2 (21González-Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris P.C. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello H.F. Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 1182-1187Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar). La presencia de canales de cloruro de 8 pS activados por cAMP también se ha determinado mediante análisis de ruido en estado estacionario de corrientes inducidas por ligandos (36Larsson H.P. Kleene S.J. Lecar H. Biophys. J. 1997; 72: 1193-1203Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (47) Google Scholar). Las membranas de los cilios sensoriales también contienen canales regulados por inositol 3-fosfato (37Honda E. Teeter J.H. Restrepo D. Brain Res. 1995; 703: 79-85Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). En ese estudio, se observaron dos tipos de canales catiónicos no selectivos por fluctuaciones de corriente en membranas de cilios olfativos de rata fusionadas en bicapas de fosfolípidos. La información eléctrica directa de los cilios sensoriales in situ fue obtenida por Frings y Lindemann (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990; 57: 1091-1094Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (31) Google Scholar), quien realizó estudios muy exigentes para determinar las propiedades biofísicas y la regulación de las conductancias iónicas en los cilios del bulbo olfatorio de la rana. Los autores lograron extraer los cilios sensoriales de las células receptoras olfativas en una pipeta de parche. A pesar de que la pipeta no formó un sello eléctrico hermético con la membrana ciliar, se recogieron corrientes de registro transitorias impulsadas por potenciales de acción derivados de la neurona olfativa. Con este método se obtuvieron umbrales odorantes en el rango picomolar (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990; 57: 1091-1094Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (31) Google Scholar), lo que indica que la afinidad del ligando es mucho mayor in situ que con las preparaciones reconstituidas. Este hallazgo también sugiere que, aunque difíciles, estos experimentos pueden proporcionar información más confiable que no está disponible por otros métodos (28Frings S. Lindemann B. J. Gen. Physiol. 1991; 97: 1-16Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 38Frings S. Benz S. Lindemann B. J. Gen. Physiol. 1991; 97: 725-747 Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar). La evidencia abarcada sugiere una abundancia de canales iónicos en los cilios sensoriales. También se han encontrado varios receptores de la proteína G, incluidos los de la somatostatina y la serotonina, en los cilios primarios de las neuronas cerebrales (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann-Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999; 89: 909-926 Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar, 14 Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000; 872: 271-275 Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). Por lo tanto, la función sensorial en los cilios está intrínsecamente relacionada con la presencia de canales funcionales en estas membranas. Hasta la fecha, no se dispone de información sobre los receptores de membrana y/o la actividad de los canales iónicos en los cilios primarios de las células epiteliales renales. Sin embargo, estudios recientes indican que los productos génicos de la enfermedad renal poliquística autosómica dominante PC1 y PC2, un nuevo miembro del canal TRP (TRPP2), están presentes en los cilios primarios de las células epiteliales renales (7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 9Pazour G.J. San Agustin J.T. Follit J.A. Rosenbaum J.L. Witman G.B. Curr. Biol. 2002; 12: R378-R380Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). Una interacción funcional entre los dos puede parecer fundamental para los eventos de señalización celular ambiental que conducen a la regulación del transporte de Ca2+ y la posterior señalización celular (15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). En el presente estudio describimos un método para adquirir datos de un solo canal de cilios primarios aislados y proporcionamos la primera evidencia directa de la presencia de canales funcionales en la membrana que recubre el cilio primario de las células epiteliales renales. Se observaron al menos tres fenotipos de canales selectivos de cationes, aunque el canal selectivo de cationes de ~ 80 pS puede ser el estado de subconductancia más prevalente de un canal grande como se observa tanto en los parches ciliares como en las membranas reconstituidas. Los presentes datos están de acuerdo con la presencia de actividad del canal de tipo TRP en los cilios primarios de las células epiteliales renales. La capacidad de parchear e identificar corrientes de un solo canal en estos orgánulos estrechos probablemente radique en el hecho de que el proceso de aislamiento hincha los cilios a dimensiones donde el área de la membrana es lo suficientemente grande como para interactuar con la pipeta de parche. El canal catiónico en los cilios primarios de las células epiteliales renales puede ayudar a mantener este compartimento despolarizado con respecto al citoplasma de la célula, como se representa en el modelo hipotético de la función ciliar (Fig. 4c). La presencia de una respuesta de AMPc es consistente con la presencia de la proteína del canal de sodio α-epitelial regulada por la proteína quinasa dependiente de AMPc en este orgánulo. Esto también está de acuerdo con los datos obtenidos en cilios sensoriales con fijación de voltaje (36Larsson H.P. Kleene S.J. Lecar H. Biophys. J. 1997; 72: 1193-1203Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (47) Google Scholar) y la presencia de receptores de la proteína G, como los de la somatostatina y la serotonina en los cilios de las neuronas cerebrales (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann-Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999; 89: 909-926 Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar, 14 Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000; 872: 271-275 Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). Por lo tanto, una alta actividad de los canales catiónicos intrínsecos en los cilios primarios no móviles de las células epiteliales renales puede contribuir a las propiedades sensoriales de este orgánulo. Agradecemos a María del Rocío Cantero, Jimena Semprine, Gustavo A. Timpanaro y a la Dra. Marisa Repetto por su excelente soporte técnico. También estamos agradecidos con el Dr. Dennis Brown por la revisión crítica del manuscrito y las sugerencias técnicas de expertos. El Centro Básico de Microscopía del Programa MGH en Biología de Membrana recibe apoyo adicional del Centro de Investigación de Diabetes y Endocrinología del Área de Boston y el Centro para el Estudio de la Enfermedad Inflamatoria Intestinal.
The primary cilium is a ubiquitous, non-motile microtubular organelle lacking the central pair of microtubules found in motile cilia. Primary cilia are surrounded by a membrane, which has a unique complement of membrane proteins, and may thus be functionally different from the plasma membrane. The function of the primary cilium remains largely unknown. However, primary cilia have important sensory transducer properties, including the response of renal epithelial cells to fluid flow or mechanical stimulation. Recently, renal cystic diseases have been associated with dysfunctional ciliary proteins. Although the sensory properties of renal epithelial primary cilia may be associated with functional channel activity in the organelle, information in this regard is still lacking. This may be related to the inherent difficulties in assessing electrical activity in this rather small and narrow organelle. In the present study, we provide the first direct electrophysiological evidence for the presence of single channel currents from isolated primary cilia of LLC-PK1 renal epithelial cells. Several channel phenotypes were observed, and addition of vasopressin increased cation channel activity, which suggests the regulation, by the cAMP pathway of ciliary conductance. Ion channel reconstitution of ciliary versus plasma membranes indicated a much higher channel density in cilia. At least three channel proteins, polycystin-2, TRPC1, and interestingly, the α-epithelial sodium channel, were immunodetected in this organelle. Ion channel activity in the primary cilium of renal cells may be an important component of its role as a sensory transducer. The primary cilium is a ubiquitous, non-motile microtubular organelle lacking the central pair of microtubules found in motile cilia. Primary cilia are surrounded by a membrane, which has a unique complement of membrane proteins, and may thus be functionally different from the plasma membrane. The function of the primary cilium remains largely unknown. However, primary cilia have important sensory transducer properties, including the response of renal epithelial cells to fluid flow or mechanical stimulation. Recently, renal cystic diseases have been associated with dysfunctional ciliary proteins. Although the sensory properties of renal epithelial primary cilia may be associated with functional channel activity in the organelle, information in this regard is still lacking. This may be related to the inherent difficulties in assessing electrical activity in this rather small and narrow organelle. In the present study, we provide the first direct electrophysiological evidence for the presence of single channel currents from isolated primary cilia of LLC-PK1 renal epithelial cells. Several channel phenotypes were observed, and addition of vasopressin increased cation channel activity, which suggests the regulation, by the cAMP pathway of ciliary conductance. Ion channel reconstitution of ciliary versus plasma membranes indicated a much higher channel density in cilia. At least three channel proteins, polycystin-2, TRPC1, and interestingly, the α-epithelial sodium channel, were immunodetected in this organelle. Ion channel activity in the primary cilium of renal cells may be an important component of its role as a sensory transducer. The primary cilium is a ubiquitous, non-motile organelle lacking the central pair of microtubules found in motile cilia (1Bray D. Cell Movements. Garland PublishingInc., New York and London1992: 265-294Google Scholar, 2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. Opin. Cell Biol. 2003; 15: 105-110Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar). Recent studies indicate that primary cilia of renal epithelial cells may have important sensory properties (3Schwartz E.A. Leonard M.L. Bizios R. Bowser S.S. Am. J. Physiol. 1997; 272: F132-F138PubMed Google Scholar). Bending of primary cilia either by fluid flow or mechanical stimulation initiates extracellular Ca2+ influx amplified by Ca2+ release from intracellular stores (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar). Renal cystic (5Morgan D. Turnpenny L. Goodship J. Dai W. Majumder K. Matthews L. Gardner A. Schuster G. Vien L. Harrison W. Elder F.F. Penman-Splitt M. Overbeek P. Strachan T. Nat. Genet. 1998; 20: 149-156Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar, 6Yoder B.K. Tousson A. Millican L. Wu J. Bugg Jr, C.E. J.A. Schafer D.F. Balkovetz Am. J. Physiol. 2002; 282: F541-F552Crossref PubMed Scopus (204) Google Scholar, 7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 8Hou X. Mrug M. Yoder B.K. Lefkowitz E.J. Kremmidiotis G. D'Eustachio P. Beier D.R. Guay-Woodford L.M. J. Clin. Investig. 2002; 109: 533-540Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar, 9Pazour G.J. San Agustin J.T. Follit J.A. Rosenbaum J.L. Witman G.B. Curr. Biol. 2002; 12: R378-R380Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar) and other diseases (10Afzelius B.A. J. Pathol. 2004; 204: 470-477Crossref PubMed Scopus (279) Google Scholar) have recently been associated with dysfunctional ciliary proteins. Although sensory function by renal epithelial primary cilia may implicate functional channel activity in the organelle, information in this regard is still completely lacking (2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. Opin. Cell Biol. 2003; 15: 105-110Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar, 11Praetorius H.A. Spring K.H. Annu. Rev. Physiol. 2005; 67: 515-529Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). Except for nodal cilia, which exhibit an unusual twirling movement (12Nonaka S. Tanaka Y. Okada Y. Takeda S. Harada A. Kanai Y. Kido M. Hirokawa N. Cell. 1998; 95: 829-837Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1225) Google Scholar), primary cilia are thought to be non-motile because of the lack of axonemal dyneins. Primary cilia, like all eukaryotic cilia and flagella, are surrounded by a membrane that is continuous with the plasma membrane with a unique complement of membrane proteins such as receptors (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann-Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999; 89: 909-926Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar, 14Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000; 872: 271-275Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar) and channel proteins such as polycystin (PC) 5The abbreviations used are: PC, polycystin; TRP, transient receptor potential, TRPC1, TRP-canonical 1; TRPP2, TRP-polycystin-2; pS, picosiemens. 5The abbreviations used are: PC, polycystin; TRP, transient receptor potential, TRPC1, TRP-canonical 1; TRPP2, TRP-polycystin-2; pS, picosiemens.-2 (7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). The function of this organelle is still largely unknown. Several hypotheses have been raised as to the potential role(s) of the primary cilium in cell function, ranging from vestigial appendage with no apparent function, to a potentially relevant role in the cell cycle, as it is derived from the centriole (2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. Opin. Cell Biol. 2003; 15: 105-110Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar). Primary cilia arise from the centrioles that organize the mitotic spindle (16Rieder C.L. Jensen C.G. Jensen L.C. J. Ultrastruct. Res. 1979; 68: 173-185Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar), and their expression is highly cell cycle-dependent. Cilia are most abundant in non-proliferating G0 cells and can often be found in cells during interphase. Cilia assemble in G1 until spindle formation is initiated by centriole separation (16Rieder C.L. Jensen C.G. Jensen L.C. J. Ultrastruct. Res. 1979; 68: 173-185Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar). Renal primary cilia extend several micrometers from their apical surface (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 17Wheatley D.N. Bowser S.S. Biol. Cell. 2000; 92: 573-582Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). A mechanosensory role of renal primary cilia has been recently implicated in cell activation. Bending of primary cilia of cultured kidney cells by either fluid flow or mechanical stimulation has recently been shown to initiate extracellular Ca2+ influx, which is amplified by Ca2+ release from intracellular stores (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 18Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2003; 191: 69-76Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar). Interestingly, the PC1·PC2 channel complex is not only present in primary cilia of renal epithelial cells (7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar) but may be a requirement for Ca2+ signaling and subsequent cell activation (15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). It is thus speculated that the Ca2+ influx signals initiated by cilia transduction may be the initial step in cell activation, including cell replication and differentiation. How this long and narrow organelle behaves as a signal transducer is still unknown. Previous studies in sensory cilia, would indicate, however, that channel activity in ciliary membranes may be an important factor in its sensory function (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990; 57: 1091-1094Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (31) Google Scholar). In this report we provide the first direct evidence for the presence of various channels phenotypes in nonmotile primary cilia of LLC-PK1 renal epithelial cells. Ciliary channel density is much higher than plasma membrane channel activity, suggesting an electrical phenomenon, where depolarization of this organelle, with respect to the cytoplasm, may contribute to its sensory function. Isolation of Cilia from LLC-PK1 Cells—Wild type LLC-PK1 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum, as reported (20Raychowdhury M.K. Ibarra C. Damiano A. Jackson Jr, G.R. Smith G.R. McLaughlin P.R. Prat A.G. Ausiello D.A. Lader A.S. Cantiello H.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 20137-20146Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar). Primary cilia from LLC-PK1 cells were isolated as follows. Confluent monolayers (2-3 weeks) were scraped with Ca2+-free phosphate-buffered saline and centrifuged for 5 min at 52 × g. The cell pellet was suspended in a high Ca2+ "deciliation" solution containing 112 mm NaCl, 3.4 mm KCl, 10 mm CaCl2, 2.4 mm NaHCO3, 2 mm HEPES, pH 7.0. Resuspended cells were shaken in this solution for 10 min at 4 °C. Ciliary membranes were separated by centrifugation at 7,700 × g for 5 min. The supernatant was loaded on top of a 45% sucrose solution in high Ca2+ saline solution and centrifuged for 1 h at 100,000 × g. The sucrose-supernatant interface band was collected and diluted (1:10) and centrifuged again for 1 h at 100,000 × g. The pellet was resuspended in normal saline solution, pH 7.0, and supplemented with 2.0 mm EGTA and 0.5 mm sucrose. Samples were aliquotted and stored at -80 °C until further use. Plasma membranes from confluent LLC-PK1 cells were obtained as reported (20Raychowdhury M.K. Ibarra C. Damiano A. Jackson Jr, G.R. Smith G.R. McLaughlin P.R. Prat A.G. Ausiello D.A. Lader A.S. Cantiello H.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 20137-20146Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar). A 50-fold higher protein content in the plasma membranes compared with the isolated cilia (1160 ± 190 μg/ml versus 15.8 ± 4.64 μg/ml, p < 0.004, n = 3) was observed by the method of Lowry. Immunochemistry—Confluent cells were fixed with paraformaldehyde (4%) and 2% sucrose, for 10 min. Cells were rinsed three times with phosphate buffer solution and permeabilized with either 0.1% Triton X-100 or 1% Nonidet P-40. Some cells were immunolabeled without permeabilization. Cells were blocked with 1% bovine serum albumin or Image-it (MP) for 30 min prior to exposure to the primary antibody. Cells were immunolabeled with anti-acetylated α-tubulin antibody (mAb, Sigma) at concentrations of 2.8 μg/ml of stock solution. The polyclonal anti-PC2 antibody (0.2 mg/ml stock) was obtained from PolyFast™ (Zymed Laboratories Inc.). The TRPC1 antibody (1:200 dilution from 0.3 mg/ml stock, Sigma) is from rabbit against a peptide corresponding to amino acids 557-571 of human TRPC1. The anti-rat α-epithelial sodium channel antibody was a kind gift from Dr. Tom Kleyman. A goat anti-rabbit secondary Alexa Fluor 594 (Molecular Probes) antibody was used at 2 μg/ml. Electron Microscopy—Isolated cilia were fixed in a solution containing 2% glutaraldehyde and Na+cacodylate. Samples were with the buffer, spun down at 90,000 × g in a TL 100 ultracentrifuge for 1 h at 4 °C. The pellet was stained for 2 h at room temperature with 2% OsO4. Conversely, aliquots (10 μl) were placed on a gold grid, wicked off with Whatman paper (#5), and negatively stained for 10 s with 2% phosphotungstic acid. Samples were observed with a Phillips CM10 electron microscope at 80 kV. Electrophysiology of Isolated Cilia—Cilium-attached patches were obtained from isolated cilia. Currents and command voltages were obtained with a Dagan 3900 patch clamp amplifier (Dagan Corp.) under voltage clamp configuration with leak subtraction adjustments. Ion channel reconstitution of ciliary membranes was conducted as reported for other membranes (21González-Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris P.C. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello H.F. Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 1182-1187Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar) with some modifications. Briefly, isolated cilia were mixed and sonicated in the lipid mix (21González-Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris P.C. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello H.F. Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 1182-1187Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar) prior to reconstitution in a lipid bilayer system. All electrical signals were filtered at 5 kHz with the internal four-pole Bessel filter (Dagan Corp.). Data were first analyzed with PClamp 6.0.3 (Axon Instruments), and the basal line of current records was manually corrected with Clampfit 8.0. The patch pipette was filled with a solution containing 140 mm NaCl, 5.0 mm KCl, 1.0 mm MgCl2, 2.5 mm CaCl2, and 10 mm HEPES, adjusted to pH 7.4 with N-methylglucamine. The bathing solution contained an identical solution, and whenever indicated it was replaced with a solution containing 145 mm KCl, 1.0 mm MgCl2, 2.5 mm CaCl2, and 10 mm HEPES, adjusted to pH 7.4 with N-methylglucamine. EGTA was added from a 100 mm stock solution. The patches were intrinsically leaky, which constrains their analyses (22Stühmer W. Roberts W.S. Almers W. Sakmann B. Neher E. Single Channel Recording. Plenum Press, New York1983: 123-132Google Scholar, 23Roberts W.M. Almers W. Rudy B. Iverson L.E. Ion Channels. 207. Academic Press Inc., New York1992: 155-176Google Scholar). Thus, the following restrictions apply to the data. Current records were only obtained under a given set of solutions, after offsetting tip potential to "zero current" in the absence of leak subtraction. This procedure was repeated each time that a solution was changed. Changes in baseline currents after experimental procedures prevented quantification. Thus, only identification of channel levels was considered relevant. Identification and Isolation of Primary Cilia from LLC-PK1 Cells—The expression of primary cilia in LLC-PK1 cells was determined by acetylatedtubulin immunocytochemical labeling, most particularly in fluid-filled domes and spontaneously formed cysts (Fig. 1a). Most cells contained identifiable cilia as a prominent thick bud and/or more elongated structures in all stages of growth. Primary cilia were detected in cells lining the wall of transporting domes (Fig. 1b). A closer look at cellular localization indicated a clear development toward the side of the nucleus (Fig. 1c). Some cilia extended several micrometers from the apical membrane, which had the distinctive fragmented pattern of acetylated tubulin (Fig. 1d). Primary cilia from confluent LLC-PK1 cells were isolated with a technique adapted from previous reports (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995; 269: C1235-C1244Crossref PubMed Google Scholar, 25Delgado R. Saavedra M.V. Schmachtenberg O. Sierralta J. Bacigalupo J. J. Neurophysiol. 2003; 90: 2022-2028Crossref PubMed Scopus (27) Google Scholar). Briefly, confluent LLC-PK1 cells were deciliated by a quick exposure to a high Ca2+ solution and concentrated in a sucrose density gradient. Isolated cilia were identified after fixation and immunolabeling with anti-acetylated tubulin antibody (Fig. 2a). Isolated cilia were further visualized and identified at higher resolution (×25,000) by electron microscopy (Fig. 2b) where ciliary stems and tips can be identified as reported (26Mitchell K.A.P. Gallagher B.C. Szabo G. Otero A.d. S. Cell Motil. Cytoskeleton. 2004; 59: 62-73Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar).FIGURE 2Experimental approach to acquiring electrical information from primary cilia. a, isolated primary cilia from LLC-PK1 renal epithelial cells were obtained with a cell deciliation procedure as described under "Experimental Procedures." Isolated cilia were visualized by immunocytochemistry at ×100 magnification after fixation and labeling with anti-acetylated tubulin antibody. b, electron micrograph of isolated cilia. Arrowheads and arrows indicate cilia and cilia tip structures, respectively, consistent with previous reports (26Mitchell K.A.P. Gallagher B.C. Szabo G. Otero A.d. S. Cell Motil. Cytoskeleton. 2004; 59: 62-73Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). Right panels detail cilia and tips. c, the patch pipette was approached under lower magnification (×40) and then switched to higher magnification (d, ×60). e, suction of the cilium to the patch pipette increased the tip resistance, which further increased by leak subtraction with the patch clamp amplifier.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) Patch Clamping of Isolated Cilia—To obtain direct electrophysiological information, isolated cilia were identified under oil phase contrast (×100) in saline solution, and after location, further visualized at lower resolution (×40) to place the patch pipette in the proximity of the isolated cilium (Fig. 2, c and d). Tip resistance was followed by applying 1-mV square pulses before and after suction of the patch pipette against the isolated cilium (Fig. 2e). Most frequently, the resistance increased after touching, indicating that vacuum suction was sufficient to produce a "leaky patch." "Leak subtraction" compensation followed with the patch clamp amplifier. Despite the intrinsic "leakiness" of the patches, channel activity was clearly observed under spontaneous conditions (n = 22/22, Fig. 3a). The most frequent ion channel observed (Fig. 3, a-d) had a single channel conductance of 83.6 ± 1.0 pS (n = 3) in symmetrical NaCl. Replacement of the bathing solution with either Na+-aspartate (71.5 ± 1.47 pS, Fig. 3d) or KCl (73.2 ± 1.58 pS, Fig. 3d) did not largely modify the single conductance, reversal potential, or rectification properties, suggesting its activity as a non-selective cation channel. Another non-selective cation channel phenotype with a single channel conductance of 173 ± 4.40 pS (n = 3) was observed in the primary cilium (Fig. 3d, inset). Whether this channel phenotype represents a "dimer" of the 83-pS channel is currently unknown. Further, a small Na+-permeable channel (8.07 ± 0.50 pS, n = 3) was also observed after the addition of AVP (10 μm, Fig. 3, e and f). The presence of V2R vasopressin receptors is being currently explored and would suggest that a local second messenger pathway is present in isolated primary cilia (to report elsewhere). Interestingly, addition of cAMP-dependent protein kinase (50 nm) and MgATP (3-6 mm) also increased cation channel activity (Fig. 3g). This suggests that vasopressin acts on a V2R, instead of a V1R-type of response. However, we do not presently know how the enzyme reaches the intraciliary compartment. It is likely, however, that both the leaky and openended nature of the isolated cilium help diffuse the drugs in place. Channel function was inhibited by addition of amiloride (5 μm, n = 4, Fig. 3h). Reconstitution of Isolated Cilia—Ciliary membrane channels were also observed by reconstitution in a lipid bilayer system (Fig. 3, i and j) in the presence of a Na+gradient (150 versus 15 mm, in cis and trans compartment, respectively). Channels were observed in 297 of 303 ciliary membranes. The most frequent cation-selective channel had a single channel conductance of 156 pS, which was inhibited by an anti-PC2 antibody (Fig. 3i). Reconstituted ciliary membranes seldom displayed 75-pS Cl--permeable channels (3/303, Fig. 3j), explaining why it was not observed in cilium-attached patches. The data indicate, however, that abundant cation-permeable channel activity is present in the ciliary membranes. A comparison of reconstituted ciliary versus plasma membranes, indicated as much as 400-fold higher channel activity in ciliary membranes as averaged mean currents were divided by protein content (Fig. 3k). Presence of Channel Proteins in the Primary Cilium—To begin an identification of the channel proteins contributing to the electrical activity of the primary cilium in renal epithelial cells immunolocalization was conducted in isolated cilia identified by co-labeling with acetylated tubulin. Several ion channels were identified in primary cilia. The TRP-type channels TRPC1 and polycystin-2 (TRPP2) were immunodetected in the primary cilia of confluent LLC-PK1 cells (Fig. 4) and also isolated cilia (data not shown). Interestingly, the epithelial Na+channel subunit α-epithelial sodium channel was also observed lining the entire surface of the primary cilium (Fig. 4b). The presence of several channel species is in agreement with the high electrodifussional permeability observed in the primary cilium, with respect to the plasma membrane. Recent evidence indicates that renal epithelial cells may sense environmental forces by mechanosensory activity of the primary cilium (4Praetorius H.A. Spring K.R. J. Membr. Biol. 2001; 184: 71-79Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). Little is known, however, about the molecular mechanisms associated with sensory function of renal primary cilia. Electrical activity in this organelle, mediated by functional ion channels, may be an important contributor to this sensory function. Among the most studied ciliary membranes are those from sensory neurons of the olfactory bulb (27Labarca P. Bacigalupo J. J. Bioenerg. Biomembr. 1988; 20: 551-569Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar, 28Frings S. Lindemann B. J. Gen. Physiol. 1991; 97: 1-16Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 29Nakamura T. Lee H.H. Kobayashi H. Satoh T.O. Biophys. J. 1996; 70: 813-817Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (22) Google Scholar, 30Murphy G.J. Isaacson J.S. Neuron. 2003; 37: 639-647Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar) and sensory cilia of ciliated invertebrates (31Fujiwara C. Anzai K. Kirino Y. Nagao S. Nozawa Y. Takahashi M. J. Biochem. (Tokyo). 1988; 104: 344-348Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar, 32Fujiwara-Hirashima C. Anzai K. Takahashi M. Kirino Y. Biochim. Biophys. Acta. 1996; 1280: 207-216Crossref PubMed Scopus (7) Google Scholar). The reconstitution of olfactory ciliary membranes in planar lipid bilayers originally conducted by Ehrlich et al. (33Ehrlich B.E. Finkelstein A. Forte M. Kung C. Science. 1984; 225: 427-428Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar) demonstrated the presence of voltage-dependent Ca2+ channels from Paramecium cilia. Reconstitution of ciliary membranes from wild type and mutant Tetrahymena thermophila also showed the presence of other cation channels (31Fujiwara C. Anzai K. Kirino Y. Nagao S. Nozawa Y. Takahashi M. J. Biochem. (Tokyo). 1988; 104: 344-348Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar, 34Oosawa Y. Sokabe M. Kasai M. Cell Struct. Funct. 1988; 13: 51-60Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar). Reconstituted sensory ciliary membranes have also allowed identification of signaling mechanisms involved in ciliary channel regulation. Labarca et al. (35Labarca P. Simon S.A. Anholt R.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988; 85: 944-947Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar) observed that ion channels from reconstituted ciliary membranes of the Rana catesbeiana olfactory epithelium, are sensitive to nanomolar concentrations of odorant ligands. This may have been one of the first demonstrations of TRP vanilloid receptor-type functional channels in cilia. Cyclic AMP activated the 23-pS cation channels in vertebrate olfactory cilia (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995; 269: C1235-C1244Crossref PubMed Google Scholar) and modulated a high conductance K+ channel, displaying several open substates with conductances of 34, 80, and 130 pS (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995; 269: C1235-C1244Crossref PubMed Google Scholar), which is highly reminiscent of PC2 function (21González-Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris P.C. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello H.F. Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 1182-1187Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar). The presence of cAMP-activated 8 pS chloride channels has also been determined by steady-state noise analysis of ligand-induced currents (36Larsson H.P. Kleene S.J. Lecar H. Biophys. J. 1997; 72: 1193-1203Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (47) Google Scholar). Sensory cilia membranes also contain inositol 3-phosphate-gated channels (37Honda E. Teeter J.H. Restrepo D. Brain Res. 1995; 703: 79-85Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). In that study, two types of non-selective cation channels were observed by current fluctuations in rat olfactory cilia membranes fused onto phospholipid bilayers. Direct electrical information from sensory cilia in situ was obtained by Frings and Lindemann (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990; 57: 1091-1094Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (31) Google Scholar), who conducted highly demanding studies to determine the biophysical properties and regulation of ionic conductances in cilia from frog olfactory bulb. The authors managed to pull sensory cilia from olfactory receptor cells into a patch pipette. Despite the fact that the pipette did not form a tight electrical seal with the ciliary membrane, transient record currents driven by action potentials arising from the olfactory neuron were collected. With this method, odorant thresholds in the picomolar range were obtained (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990; 57: 1091-1094Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (31) Google Scholar), indicating that ligand affinity is much higher in situ than with reconstituted preparations. This finding also suggests that, however difficult, these experiments may provide more reliable information not available by other methods (28Frings S. Lindemann B. J. Gen. Physiol. 1991; 97: 1-16Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 38Frings S. Benz S. Lindemann B. J. Gen. Physiol. 1991; 97: 725-747Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar). The encompassed evidence suggests an abundance of ion channels in sensory cilia. Several G protein receptors, including those for somatostatin and serotonin have also been found in primary cilia of brain neurons (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann-Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999; 89: 909-926Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar, 14Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000; 872: 271-275Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). Thus sensory function in cilia is intrinsically related to the presence of functional channels in these membranes. To date, no information is available on either membrane receptors and/or ion channel activity in primary cilia from renal epithelial cells. Recent studies indicate, however, that the autosomal dominant polycystic kidney disease gene products PC1 and PC2, a novel TRP channel member (TRPP2), are present in the primary cilia of renal epithelial cells (7Yoder B.K. Hou X. Guay-Woodford L.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 9Pazour G.J. San Agustin J.T. Follit J.A. Rosenbaum J.L. Witman G.B. Curr. Biol. 2002; 12: R378-R380Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). A functional interaction between the two may seem central to environmental cell signaling events leading to Ca2+ transport regulation and subsequent cell signaling (15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar). In the present study we described a method to acquire single channel data from isolated primary cilia and provided the first direct evidence for the presence of functional channels in the membrane coating the primary cilium of renal epithelial cells. At least three cation-selective channel phenotypes were observed, although the ∼80-pS cation-selective channel may be the most prevalent subconductance state of a large channel as observed in both ciliary patches and reconstituted membranes. The present data are in agreement with the presence of TRP-type channel activity in primary cilia from renal epithelial cells. An ability to patch and identify single channel currents in these narrow organelles may likely lie in the fact that the process of isolation swells the cilia to dimensions where the membrane area is large enough to interact with the patch pipette. Cation channel in primary cilia of renal epithelial cells may help maintain this compartment depolarized with respect to the cytoplasm of the cell, as depicted in the hypothetical model of ciliary function (Fig. 4c). The presence of a cAMP response is consistent with the presence of the cAMP-dependent protein kinase-regulated α-epithelial sodium channel protein in this organelle. This also is in agreement with data obtained in voltage-clamped sensory cilia (36Larsson H.P. Kleene S.J. Lecar H. Biophys. J. 1997; 72: 1193-1203Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (47) Google Scholar) and the presence G protein receptors, such as those for somatostatin and serotonin in the cilia of brain neurons (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann-Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999; 89: 909-926Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar, 14Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000; 872: 271-275Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). Thus high intrinsic cation channel activity in non-motile primary cilia of renal epithelial cells may contribute to the sensory properties of this organelle. We thank María del Rocío Cantero, Jimena Semprine, Gustavo A. Timpanaro, and Dr. Marisa Repetto for excellent technical support. We are also thankful to Dr. Dennis Brown, for critical proofing of the manuscript and expert technical suggestions. The Microscope Core Facility of the MGH Program in Membrane Biology receives additional support from the Boston Area Diabetes and Endocrinology Research Center and the Center for the Study of Inflammatory Bowel Disease.
الأهداب الأولية هي عضية مجهرية غير متحركة في كل مكان تفتقر إلى الزوج المركزي من الأنابيب الدقيقة الموجودة في الأهداب المتحركة. يحيط بالأهداب الأولية غشاء، يحتوي على مكمل فريد من البروتينات الغشائية، وبالتالي قد يكون مختلفًا وظيفيًا عن غشاء البلازما. لا تزال وظيفة الهدب الأولي غير معروفة إلى حد كبير. ومع ذلك، فإن الأهداب الأولية لها خصائص محولة حسية مهمة، بما في ذلك استجابة الخلايا الظهارية الكلوية لتدفق السوائل أو التحفيز الميكانيكي. في الآونة الأخيرة، ارتبطت الأمراض الكيسية الكلوية بالبروتينات الهدبية المختلة. على الرغم من أن الخصائص الحسية للأهداب الأولية الظهارية الكلوية قد ترتبط بنشاط القناة الوظيفية في العضيات، إلا أن المعلومات في هذا الصدد لا تزال غير متوفرة. قد يكون هذا مرتبطًا بالصعوبات الكامنة في تقييم النشاط الكهربائي في هذه العضيات الصغيرة والضيقة إلى حد ما. في هذه الدراسة، نقدم أول دليل فيزيولوجي كهربائي مباشر على وجود تيارات أحادية القناة من الأهداب الأولية المعزولة للخلايا الظهارية الكلوية LLC - PK1. لوحظت العديد من الأنماط الظاهرية للقناة، وإضافة فاسوبريسين زاد من نشاط قناة الكاتيون، مما يشير إلى التنظيم، من خلال مسار المخيم للتوصيل الهدبي. أشارت إعادة تكوين القناة الأيونية للأغشية الهدبية مقابل أغشية البلازما إلى كثافة قناة أعلى بكثير في الأهداب. تم الكشف عن ثلاثة بروتينات قناة على الأقل، بوليسيستين -2، TRPC1، ومن المثير للاهتمام، قناة الصوديوم ألفا الظهارية، في هذه العضيات. قد يكون نشاط القناة الأيونية في الأهداب الأولية للخلايا الكلوية مكونًا مهمًا لدورها كمحول حسي. الأهداب الأولية هي عضية مجهرية غير متحركة في كل مكان تفتقر إلى الزوج المركزي من الأنابيب الدقيقة الموجودة في الأهداب المتحركة. يحيط بالأهداب الأولية غشاء، يحتوي على مكمل فريد من البروتينات الغشائية، وبالتالي قد يكون مختلفًا وظيفيًا عن غشاء البلازما. لا تزال وظيفة الهدب الأولي غير معروفة إلى حد كبير. ومع ذلك، فإن الأهداب الأولية لها خصائص محولة حسية مهمة، بما في ذلك استجابة الخلايا الظهارية الكلوية لتدفق السوائل أو التحفيز الميكانيكي. في الآونة الأخيرة، ارتبطت الأمراض الكيسية الكلوية بالبروتينات الهدبية المختلة. على الرغم من أن الخصائص الحسية للأهداب الأولية الظهارية الكلوية قد ترتبط بنشاط القناة الوظيفية في العضيات، إلا أن المعلومات في هذا الصدد لا تزال غير متوفرة. قد يكون هذا مرتبطًا بالصعوبات الكامنة في تقييم النشاط الكهربائي في هذه العضيات الصغيرة والضيقة إلى حد ما. في هذه الدراسة، نقدم أول دليل فيزيولوجي كهربائي مباشر على وجود تيارات أحادية القناة من الأهداب الأولية المعزولة للخلايا الظهارية الكلوية LLC - PK1. لوحظت العديد من الأنماط الظاهرية للقناة، وإضافة فاسوبريسين زاد من نشاط قناة الكاتيون، مما يشير إلى التنظيم، من خلال مسار المخيم للتوصيل الهدبي. أشارت إعادة تكوين القناة الأيونية للأغشية الهدبية مقابل أغشية البلازما إلى كثافة قناة أعلى بكثير في الأهداب. تم الكشف عن ثلاثة بروتينات قناة على الأقل، بوليسيستين -2، TRPC1، ومن المثير للاهتمام، قناة الصوديوم ألفا الظهارية، في هذه العضيات. قد يكون نشاط القناة الأيونية في الأهداب الأولية للخلايا الكلوية مكونًا مهمًا لدورها كمحول حسي. الأهداب الأولية هي عضية غير متحركة في كل مكان تفتقر إلى الزوج المركزي من الأنابيب الدقيقة الموجودة في الأهداب المتحركة (1Bray D. حركات الخلية. Garland PublishingInc.، نيويورك ولندن 1992: 265-294 الباحث العلمي من Google، 2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. الرأي. خلية بيول. 2003 ؛ 15: 105-110 Crossref PubMed Scopus (371) الباحث العلمي من Google). تشير الدراسات الحديثة إلى أن الأهداب الأولية للخلايا الظهارية الكلوية قد يكون لها خصائص حسية مهمة (3Schwartz E.A. Leonard M.L. Bizios R. Bowser S.S. Am. J. Physiol. 1997 ؛ 272: F132 - F138PubMed الباحث العلمي من Google). يؤدي انحناء الأهداب الأولية إما عن طريق تدفق السوائل أو التحفيز الميكانيكي إلى بدء التدفق خارج الخلية Ca2 + المتضخم بواسطة إطلاق Ca2 + من المخازن داخل الخلايا (4Praetorius H.A. Spring KRJ Membr. بيول. 2001 ؛ 184: 71-79 Crossref PubMed Scopus (656) الباحث العلمي من Google). الكيس الكلوي (5Morgan D. Turnpenny L. Goodship J. Dai W. Majumder K. Matthews L. Gardner A. Schuster G. Vien L. Harrison W. Elder F. F. Penman - Splitt M. Overbeek P. Strachan T. Nat. Genet. 1998; 20: 149-156 Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar, 6Yoder B.K. Tousson A. Millican L. Wu J. Bugg Jr, C.E. J.A. Schafer D.F. Balkovetz Am. J. Physiol. 2002; 282: F541 - F552Crossref PubMed Scopus (204) Google Scholar, 7Yoder B.K. Hou X. Guay - Woodford LMJ Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516 Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 8Hou X. Mrug M. Yoder B.K. Lefkowitz E.J. Kremmidiotis G. D'Eustachio P. Beier D.R. Guay - Woodford L.M.J. Clin. Investig. 2002; 109: 533-540 Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar, 9Pazour G.J. San Agustin J.T. Follit J.A. Rosenbaum J.L. Witman G.B. Curr. Biol. 2002; 12: R378 - R380Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar) وأمراض أخرى (10Afzelius B.A. J. Pathol. 2004 ؛ 204: 470-477 ارتبط كروسريف بوبمد سكوبس (279) الباحث العلمي من جوجل) مؤخرًا بالبروتينات الهدبية المختلة. على الرغم من أن الوظيفة الحسية عن طريق الأهداب الأولية الظهارية الكلوية قد تنطوي على نشاط القناة الوظيفية في العضيات، إلا أن المعلومات في هذا الصدد لا تزال مفقودة تمامًا (2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. Opin. Cell Biol. 2003; 15: 105-110 Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar, 11Praetorius H.A. Spring K.H. Annu. Rev. Physiol. 2005; 67: 515-529 Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). باستثناء الأهداب العقدية، التي تظهر حركة دوارة غير عادية (12Nonaka S. Tanaka Y. Okada Y. Takeda S. Harada A. Kanai Y. Kido M. Hirokawa N. Cell. 1998 ؛ 95: 829-837 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (1225) الباحث العلمي من Google)، يُعتقد أن الأهداب الأولية غير متحركة بسبب نقص داينين المحورية. الأهداب الأولية، مثل جميع الأهداب حقيقية النواة والسوط، محاطة بغشاء مستمر مع غشاء البلازما مع مجموعة فريدة من البروتينات الغشائية مثل المستقبلات (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann - Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999 ؛ 89: 909-926 Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar، 14Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000 ؛ 872: 271-275 Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar) وبروتينات القناة مثل polycystin (PC) 5 الاختصارات المستخدمة هي: PC، polycystin ؛ TRP، جهد المستقبل العابر، TRPC1، TRP - canonical 1 ؛ TRPP2، TRP - polycystin -2 ؛ PS، picosiemens. 5 الاختصارات المستخدمة هي: PC, polycystin; TRP, transient receptor potential, TRPC1, TRP - canonical 1; TRPP2, TRP - polycystin -2; pS, picosiemens.-2 (7Yoder B.K. Hou X. Guay - Woodford LMJ Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516 Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003 ؛ 33: 129-137 Crossref PubMed Scopus (1585) الباحث العلمي من Google). لا تزال وظيفة هذه العضية غير معروفة إلى حد كبير. أثيرت العديد من الفرضيات فيما يتعلق بالدور(الأدوار) المحتملة للأهداب الأولية في وظيفة الخلية، بدءًا من اللواحق الأثرية التي لا توجد لها وظيفة واضحة، إلى الدور المحتمل ذي الصلة في دورة الخلية، حيث إنه مشتق من المركز (2Pazour G.J. Witman G.B. Curr. الرأي. خلية بيول. 2003 ؛ 15: 105-110 Crossref PubMed Scopus (371) الباحث العلمي من Google). تنشأ الأهداب الأولية من المراكز التي تنظم المغزل الفتيلي (16Rieder C.L. Jensen C.G. Jensen L.C. J. Ultrastruct. Res. 1979; 68: 173-185 Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar)، ويعتمد تعبيرهم بشكل كبير على دورة الخلية. تكون الأهداب أكثر وفرة في خلايا G0 غير المنتشرة ويمكن العثور عليها غالبًا في الخلايا أثناء الطور البيني. تتجمع الأهداب في G1 حتى يبدأ تكوين المغزل عن طريق فصل المركز (16Rieder C.L. Jensen C.G. Jensen L.C. J. Ultrastruct. Res. 1979; 68: 173-185 Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar). تمتد الأهداب الأولية الكلوية عدة ميكرومترات من سطحها القمي (4Praetorius H.A. Spring KRJ Membr. Biol. 2001; 184: 71-79 Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 17Wheatley D.N. Bowser S.S. Biol. الخلية. 2000 ؛ 92: 573-582 Crossref PubMed Scopus (26) الباحث العلمي من Google). وقد تورط الدور الحسي الميكانيكي للأهداب الأولية الكلوية مؤخرًا في تنشيط الخلايا. ثبت مؤخرًا أن انحناء الأهداب الأولية لخلايا الكلى المستزرعة إما عن طريق تدفق السوائل أو التحفيز الميكانيكي يؤدي إلى بدء تدفق Ca2 + خارج الخلية، والذي يتم تضخيمه عن طريق إطلاق Ca2 + من المخازن داخل الخلايا (4Praetorius H.A. Spring KRJ Membr. Biol. 2001; 184: 71-79 Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar, 18Praetorius H.A. Spring KRJ Membr. بيول. 2003 ؛ 191: 69-76 Crossref PubMed Scopus (267) الباحث العلمي من Google). ومن المثير للاهتمام، أن مجمع قناة PC1 · PC2 لا يوجد فقط في الأهداب الأولية للخلايا الظهارية الكلوية (7Yoder B.K. Hou X. Guay - Woodford LMJ Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516 Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003; 33: 129-137 Crossref PubMed Scopus (1585) Google Scholar) ولكن قد يكون شرطًا لإشارة Ca2 + وتنشيط الخلية اللاحق (15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003 ؛ 33: 129-137 Crossref PubMed Scopus (1585) الباحث العلمي من Google). وبالتالي، يُتوقع أن تكون إشارات تدفق Ca2 + التي يبدأها نقل الأهداب هي الخطوة الأولى في تنشيط الخلية، بما في ذلك تكاثر الخلايا وتمايزها. لا تزال الطريقة التي تتصرف بها هذه العضيات الطويلة والضيقة كمحول إشارة غير معروفة. ومع ذلك، تشير الدراسات السابقة في الأهداب الحسية إلى أن نشاط القناة في الأغشية الهدبية قد يكون عاملاً مهمًا في وظيفتها الحسية (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990 ؛ 57: 1091-1094 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (31) الباحث العلمي من Google). في هذا التقرير، نقدم أول دليل مباشر على وجود أنماط ظاهرية مختلفة القنوات في الأهداب الأولية غير المتحركة للخلايا الظهارية الكلوية LLC - PK1. كثافة القناة الهدبية أعلى بكثير من نشاط قناة غشاء البلازما، مما يشير إلى ظاهرة كهربائية، حيث قد يساهم إزالة الاستقطاب من هذه العضيات، فيما يتعلق بالسيتوبلازم، في وظيفتها الحسية. تم استزراع عزل أهداب من خلايا LLC - PK1 - Wild من نوع LLC - PK1 في وسط Dulbecco المعدل من Eagle المضاف إليه 10 ٪ من مصل الأبقار الجنيني، كما ورد (20 Raychowdhury MK Ibarra C. Damiano A. Jackson Jr، GR Smith GR McLaughlin P.R. Prat A.G. Ausiello D.A. Lader A.S. Cantiello HF. J. Biol. Chem. 2004; 279: 20137-20146Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar). تم عزل الأهداب الأولية من خلايا LLC - PK1 على النحو التالي. تم كشط الطبقات الأحادية المتلاقية (2-3 أسابيع) بمحلول ملحي خالٍ من الفوسفات Ca2 + وطردها مركزيًا لمدة 5 دقائق عند 52 × جم. تم تعليق الكرية الخلوية في محلول "انحلال" عالي Ca2 + يحتوي على 112 مم NaCl، 3.4 مم KCl، 10 مم CaCl2، 2.4 مم NaHCO3، 2 مم HEPES، pH 7.0. تم هز الخلايا العالقة في هذا المحلول لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم فصل الأغشية الهدبية عن طريق الطرد المركزي عند 7700 × جم لمدة 5 دقائق. تم تحميل المادة الطافية فوق محلول سكروز بنسبة 45 ٪ في محلول ملحي عالي الكالسيوم 2+ وطردها مركزيًا لمدة ساعة واحدة عند 100000 × جم. تم جمع شريط الواجهة الساطع للسكروز وتخفيفه (1:10) وطرده مرة أخرى لمدة ساعة واحدة عند 100000 × جم. تم إعادة تعليق الحبيبة في محلول ملحي طبيعي، درجة الحموضة 7.0، واستكملت بـ 2.0 مم من EGTA و 0.5 مم من السكروز. تم تقسيم العينات وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. تم الحصول على أغشية البلازما من خلايا كونفلوينت LLC - PK1 كما هو مذكور (20Raychowdhury M.K. Ibarra C. Damiano A. Jackson Jr, G.R. Smith G.R. McLaughlin P.R. Prat A.G. Ausiello D.A. Lader A.S. Cantiello H.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 20137-20146Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar). لوحظ وجود محتوى بروتيني أعلى بمقدار 50 ضعفًا في أغشية البلازما مقارنة بالأهداب المعزولة (1160 ± 190 ميكروغرام/مل مقابل 15.8 ± 4.64 ميكروغرام/مل، p < 0.004، n = 3) بواسطة طريقة لوري. الكيمياء المناعية - تم تثبيت الخلايا الطليقة مع بارافورمالدهيد (4 ٪) و 2 ٪ سكروز، لمدة 10 دقائق. تم شطف الخلايا ثلاث مرات بمحلول عازل للفوسفات وتخللها إما 0.1 ٪ Triton X -100 أو 1 ٪ Nonidet P -40. تم تسمية بعض الخلايا بالمناعة دون نفاذية. تم حظر الخلايا باستخدام 1 ٪ من ألبومين مصل البقر أو Image - it (MP) لمدة 30 دقيقة قبل التعرض للجسم المضاد الأولي. تم تسمية الخلايا مناعيًا بالأجسام المضادة α - tubulin المضادة للأسيتيل (MAB، Sigma) بتركيزات 2.8 ميكروغرام/مل من محلول المخزون. تم الحصول على الجسم المضاد لـ PC2 متعدد النسائل (0.2 مجم/مل من المخزون) من PolyFast™ (Zymed Laboratories Inc.). الجسم المضاد TRPC1 (تخفيف 1:200 من مخزون 0.3 مجم/مل، سيجما) هو من الأرانب مقابل الببتيد المقابل للأحماض الأمينية 557-571 من TRPC1 البشري. كان الجسم المضاد لقناة الصوديوم ألفا الظهاري المضاد للفئران هدية طيبة من الدكتور توم كلايمان. تم استخدام جسم مضاد ثانوي للماعز مضاد للأرانب أليكسا فلور 594 (تحقيقات جزيئية) عند 2 ميكروغرام/مل. تم تثبيت الأهداب المعزولة بالمجهر الإلكتروني في محلول يحتوي على 2 ٪ من الجلوتارالدهيد و Na+cacodylate. كانت العينات مع العازل، تم نسجها عند 90,000 × جم في جهاز طرد مركزي فائق TL 100 لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. تم تلطيخ الحبيبة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة بنسبة 2 ٪ OsO4. على العكس من ذلك، تم وضع السوائل (10 ميكرولتر) على شبكة ذهبية، وتم التخلص منها بورق Whatman (#5)، وتم تلطيخها سلبًا لمدة 10 ثوانٍ بحمض الفوسفوتونغستيك 2 ٪. لوحظت عينات باستخدام مجهر إلكتروني فيليبس CM10 عند 80 كيلو فولت. تم الحصول على الفيزيولوجيا الكهربية للبقع المعزولة المرتبطة بالهدب والأهداب من الأهداب المعزولة. تم الحصول على التيارات وجهد الأوامر باستخدام مضخم مشبك التصحيح Dagan 3900 (Dagan Corp.) تحت تكوين مشبك الجهد مع تعديلات طرح التسرب. تم إجراء إعادة تكوين القناة الأيونية للأغشية الهدبية كما هو مذكور للأغشية الأخرى (21González - Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris P.C. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello HF Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001 ؛ 98: 1182-1187 Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar) مع بعض التعديلات. باختصار، تم خلط الأهداب المعزولة وصوتها في مزيج الدهون (21González - Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano AE Zotta E. Batelli M. Harris P.C. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello HF Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001 ؛ 98: 1182-1187 Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar) قبل إعادة التكوين في نظام ثنائي الطبقة الدهنية. تم ترشيح جميع الإشارات الكهربائية بسرعة 5 كيلو هرتز باستخدام فلتر Bessel الداخلي رباعي الأقطاب (Dagan Corp.). تم تحليل البيانات لأول مرة باستخدام PClamp 6.0.3 (أدوات Axon)، وتم تصحيح الخط الأساسي للسجلات الحالية يدويًا باستخدام Clampfit 8.0. تم ملء ماصة التصحيح بمحلول يحتوي على 140 مم كلوريد الصوديوم، 5.0 مم كلوريد الكالسيوم، 1.0 مم كلوريد المغنيسيوم، 2.5 مم كلوريد الكالسيوم، و 10 مم هيبس، مضبوطة على الرقم الهيدروجيني 7.4 مع N - ميثيل جلوكامين. يحتوي محلول الاستحمام على محلول مماثل، وكلما تمت الإشارة إليه، تم استبداله بمحلول يحتوي على 145 مم KCl و 1.0 مم MgCl2 و 2.5 مم CaCl2 و 10 مم HEPES، مع ضبطه على الرقم الهيدروجيني 7.4 باستخدام N - methylglucamine. تمت إضافة EGTA من محلول مخزون 100 مم. كانت البقع متسربة في جوهرها، مما يقيد تحليلاتها (22 Stühmer W. Roberts W. S. Almers W. Sakmann B. Neher E. Single Channel Recording. مطبعة الجلسة المكتملة، نيويورك 1983: 123-132 الباحث العلمي من Google، 23 روبرتس دبليو إم ألميرس دبليو رودي بي إيفرسون إل إي أيون تشانلز. 207. أكاديميك برس إنك، نيويورك 1992: 155-176 الباحث العلمي من جوجل). وبالتالي، تنطبق القيود التالية على البيانات. تم الحصول على السجلات الحالية فقط في إطار مجموعة معينة من الحلول، بعد تعويض إمكانات الطرف إلى "تيار صفري" في حالة عدم طرح التسرب. تم تكرار هذا الإجراء في كل مرة يتم فيها تغيير الحل. حالت التغييرات في التيارات الأساسية بعد الإجراءات التجريبية دون القياس الكمي. وبالتالي، اعتُبر تحديد مستويات القناة فقط ذا صلة. تحديد وعزل الأهداب الأولية من خلايا LLC - PK1 - تم تحديد التعبير عن الأهداب الأولية في خلايا LLC - PK1 عن طريق وضع العلامات الكيميائية المناعية للأسيتيل توبولين، وعلى الأخص في القباب المملوءة بالسوائل والخراجات المتكونة تلقائيًا (الشكل 1 أ). تحتوي معظم الخلايا على أهداب يمكن تحديدها على أنها برعم سميك بارز و/أو هياكل أكثر استطالة في جميع مراحل النمو. تم اكتشاف أهداب أولية في الخلايا المبطنة لجدار القباب الناقلة (الشكل 1 ب). أشارت نظرة فاحصة على التوطين الخلوي إلى تطور واضح نحو جانب النواة (الشكل 1 ج). امتدت بعض الأهداب عدة ميكرومترات من الغشاء القمي، الذي كان له نمط مجزأ مميز من التوبولين الأسيتيل (الشكل 1 د). تم عزل الأهداب الأولية من خلايا كونفلوينت LLC - PK1 بتقنية مقتبسة من التقارير السابقة (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995; 269: C1235 - C1244Crossref PubMed Google Scholar, 25Delgado R. Saavedra M.V. Schmachtenberg O. Sierralta J. Bacigalupo J. Neurophysiol. 2003 ؛ 90: 2022-2028 Crossref PubMed Scopus (27) الباحث العلمي من Google). باختصار، تم تفكيك خلايا LLC - PK1 المتلاصقة من خلال التعرض السريع لمحلول عالٍ من Ca2 + وتركيزها في تدرج كثافة السكروز. تم تحديد الأهداب المعزولة بعد التثبيت والتسمية المناعية بالأجسام المضادة للأنبوبولين المضاد للأسيتيل (الشكل 2 أ). تم تصوير الأهداب المعزولة بشكل أكبر وتحديدها بدقة أعلى (×25000) بواسطة المجهر الإلكتروني (الشكل 2 ب) حيث يمكن تحديد السيقان والأطراف الهدبية كما هو مذكور (26Mitchell K.A.P. Gallagher B.C. Szabo G. Otero A.D. S. Cell Motil. الهيكل الخلوي. 2004 ؛ 59: 62-73 Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). الشكل 2 النهج التجريبي للحصول على المعلومات الكهربائية من الأهداب الأولية. أ، تم الحصول على الأهداب الأولية المعزولة من الخلايا الظهارية الكلوية LLC - PK1 من خلال إجراء تفكيك الخلايا كما هو موضح تحت عنوان "الإجراءات التجريبية"."تم تصوير الأهداب المعزولة بواسطة الكيمياء المناعية عند التكبير ×100 بعد التثبيت ووضع العلامات مع الجسم المضاد للأنبوبولين المضاد للأسيتيل. ب، صورة مجهرية إلكترونية للأهداب المعزولة. تشير رؤوس الأسهم والسهام إلى هياكل رأس الأهداب والأهداب، على التوالي، بما يتفق مع التقارير السابقة (26Mitchell K.A.P. Gallagher B.C. Szabo G. Otero A.D. S. Cell Motil. الهيكل الخلوي. 2004 ؛ 59: 62-73 Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). تفاصيل الألواح اليمنى الأهداب والأطراف. ج، تم الاقتراب من ماصة التصحيح تحت التكبير السفلي (×40) ثم تم تحويلها إلى تكبير أعلى (d، ×60). هـ، أدى شفط الأهداب إلى ماصة التصحيح إلى زيادة مقاومة الطرف، والتي زادت بشكل أكبر عن طريق طرح التسرب باستخدام مضخم مشبك التصحيح. عرض عارض الشكل الكبير للصورة تنزيل مشبك التصحيح عالي الدقة (PPT) لأهداب معزولة - للحصول على معلومات فسيولوجية كهربائية مباشرة، تم تحديد الأهداب المعزولة تحت تباين طور الزيت (×100) في محلول ملحي، وبعد الموقع، تم تصويرها بشكل أكبر بدقة أقل (×40) لوضع ماصة التصحيح بالقرب من الأهداب المعزولة (الشكل 2، ج و د). وأعقب مقاومة الطرف وضع نبضات مربعة 1 مللي فولت قبل وبعد شفط ماصة التصحيح ضد الهدب المعزول (الشكل 2 هـ). في معظم الأحيان، زادت المقاومة بعد اللمس، مما يشير إلى أن شفط الفراغ كان كافيًا لإنتاج "رقعة متسربة.تعويض "طرح التسرب" متبوعًا بمضخم مشبك التصحيح. على الرغم من "التسرب" الجوهري للبقع، فقد لوحظ نشاط القناة بوضوح في ظل ظروف تلقائية (n = 22/22، الشكل 3 أ). كان للقناة الأيونية الأكثر شيوعًا التي تمت ملاحظتها (الشكل 3، أ- د) موصلية أحادية القناة تبلغ 83.6 ± 1.0 pS (n = 3) في كلوريد الصوديوم المتماثل. إن استبدال محلول الاستحمام إما بـ Na+ - aspartate (71.5 ± 1.47 pS، الشكل 3d) أو KCl (73.2 ± 1.58 pS، الشكل 3d) لم يعدل إلى حد كبير خصائص التوصيل الفردي أو جهد الانعكاس أو التصحيح، مما يشير إلى نشاطه كقناة كاتيونية غير انتقائية. لوحظ نمط ظاهري آخر لقناة الكاتيون غير الانتقائي مع موصلية أحادية القناة تبلغ 173 ± 4.40 pS (n = 3) في الهدب الأولي (الشكل 3d، إدراج). ما إذا كان هذا النمط الظاهري للقناة يمثل "ديمر" لقناة 83 - pS غير معروف حاليًا. علاوة على ذلك، لوحظت أيضًا قناة صغيرة من نفاذية Na+ (8.07 ± 0.50 pS، n = 3) بعد إضافة AVP (10 ميكرومتر، الشكل 3، e و f). يتم حاليًا استكشاف وجود مستقبلات V2R vasopressin، مما يشير إلى وجود مسار مرسل ثانٍ محلي في الأهداب الأولية المعزولة (للإبلاغ في مكان آخر). ومن المثير للاهتمام أن إضافة بروتين كيناز المعتمد على المخيم (50 نانومتر) و MgATP (3-6 مم) زاد أيضًا من نشاط قناة الكاتيون (الشكل 3 جم). يشير هذا إلى أن فاسوبريسين يعمل على استجابة V2R، بدلاً من نوع استجابة V1R. ومع ذلك، لا نعرف حاليًا كيف يصل الإنزيم إلى الحجرة داخل الهدبية. ومع ذلك، من المحتمل أن تساعد الطبيعة المتسربة والمفتوحة للأهداب المعزولة في نشر الأدوية الموجودة. تم تثبيط وظيفة القناة عن طريق إضافة الأميلوريد (5 ميكرومتر، n = 4، الشكل 3 ساعات). كما لوحظت إعادة تكوين القنوات الغشائية الهدبية الهدبية المعزولة عن طريق إعادة التكوين في نظام ثنائي الطبقة الدهنية (الشكل 3 و i و j) في وجود تدرج Na+ (150 مقابل 15 مم، في رابطة الدول المستقلة والحجرة العابرة، على التوالي). لوحظت القنوات في 297 من 303 غشاء هدبي. كان للقناة الانتقائية الكاتيونية الأكثر شيوعًا موصلية أحادية القناة تبلغ 156 pS، والتي تم تثبيطها بواسطة جسم مضاد لـ PC2 (الشكل 3i). نادرًا ما تعرض الأغشية الهدبية المعاد تشكيلها قنوات 75 - pS Cl - ذات نفاذية (3/303، الشكل 3j)، موضحة سبب عدم ملاحظتها في البقع المرتبطة بالهدب. ومع ذلك، تشير البيانات إلى أن نشاط القناة الوفير المنفذ للكاتيونات موجود في الأغشية الهدبية. أشارت مقارنة بين الأغشية الهدبية المعاد تشكيلها مقابل أغشية البلازما، إلى ما يصل إلى 400 ضعف نشاط القناة الأعلى في الأغشية الهدبية حيث تم تقسيم متوسط التيارات على محتوى البروتين (الشكل 3 ك). وجود بروتينات القناة في الأهداب الأولية - لبدء تحديد بروتينات القناة التي تساهم في النشاط الكهربائي للأهداب الأولية في الخلايا الظهارية الكلوية، تم إجراء التوطين المناعي في أهداب معزولة تم تحديدها عن طريق وضع العلامات المشتركة مع التوبولين الأسيتيل. تم تحديد العديد من القنوات الأيونية في الأهداب الأولية. تم الكشف عن القنوات من نوع TRP TRPC1 و polycystin -2 (TRPP2) مناعيًا في الأهداب الأولية لخلايا LLC - PK1 المتلاصقة (الشكل 4) وأيضًا أهداب معزولة (البيانات غير موضحة). ومن المثير للاهتمام، لوحظ أيضًا أن الوحدة الفرعية لقناة Na+ الظهارية α -قناة الصوديوم الظهارية تبطن كامل سطح الهدب الأولي (الشكل 4 ب). يتوافق وجود العديد من أنواع القنوات مع النفاذية الكهربائية العالية الملحوظة في الهدب الأولي، فيما يتعلق بغشاء البلازما. تشير الأدلة الحديثة إلى أن الخلايا الظهارية الكلوية قد تستشعر القوى البيئية من خلال النشاط الحسي الميكانيكي للأهداب الأولية (4Praetorius H.A. Spring KRJ Membr. بيول. 2001 ؛ 184: 71-79 كروسريف بوب ميد سكوبس (656) الباحث العلمي من غوغل، 15 ناولي س. م. ألنغات ف. ج. لو واي. ويليامز إي. فاسيليف ب. لي إكس. إيليا إيه. إي. إتش. لو دبليو. براون إي. إم. كوين إس. جي. إنغبر دي. إي. تشو ج. نات. Genet. 2003 ؛ 33: 129-137 Crossref PubMed Scopus (1585) الباحث العلمي من Google). ومع ذلك، لا يُعرف سوى القليل عن الآليات الجزيئية المرتبطة بالوظيفة الحسية للأهداب الأولية الكلوية. قد يكون النشاط الكهربائي في هذه العضوية، بوساطة قنوات أيونية وظيفية، مساهمًا مهمًا في هذه الوظيفة الحسية. من بين الأغشية الهدبية الأكثر دراسة تلك الموجودة في الخلايا العصبية الحسية للبصلة الشمية (27Labarca P. Bacigalupo JJ Bioenerg. Biomembr. 1988 ؛ 20: 551-569 Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar، 28Frings S. Lindemann BJ Gen. Physiol. 1991; 97: 1-16 Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 29Nakamura T. Lee H.H. Kobayashi H. Satoh T.O. Biophys. J. 1996; 70: 813-817 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (22) Google Scholar, 30Murphy G.J. Isaacson J.S. Neuron. 2003 ؛ 37: 639-647 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (38) الباحث العلمي من Google) والأهداب الحسية لللافقاريات الهدبية (31Fujiwara C. Anzai K. Kirino Y. Nagao S. Nozawa Y. Takahashi MJ Biochem. (طوكيو). 1988 ؛ 104: 344-348 كروسريف بوبميد سكوبس (9) جوجل سكولار، 32 فوجيوارا- هيراشيما سي أنزاي ك. تاكاهاشي م. كيرينو ي. بيوتشيم. Biophys. Acta. 1996; 1280: 207-216 Crossref PubMed Scopus (7) Google Scholar). إعادة تكوين الأغشية الهدبية الشمية في طبقات الدهون المستوية التي أجراها في الأصل إيرليخ وآخرون. (33 Ehrlich B.E. Finkelstein A. Forte M. Kung C. Science. 1984 ؛ 225: 427-428 أظهر Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar) وجود قنوات Ca2 + المعتمدة على الجهد من Paramecium cilia. كما أظهرت إعادة تكوين الأغشية الهدبية من النوع البري والمتحور Tetrahymena thermophila وجود قنوات كاتيونية أخرى (31 Fujiwara C. Anzai K. Kirino Y. Nagao S. Nozawa Y. Takahashi MJ Biochem. (طوكيو). 1988 ؛ 104: 344-348 Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar، 34Oosawa Y. Sokabe M. Kasai M. Cell Struct. الوظيفة. 1988 ؛ 13: 51-60 Crossref PubMed Scopus (9) الباحث العلمي من Google). كما سمحت الأغشية الهدبية الحسية المعاد تشكيلها بتحديد آليات الإشارة المشاركة في تنظيم القناة الهدبية. لاباركا وآخرون (35Labarca P. Simon S.A. Anholt R.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988 ؛ 85: 944-947 لاحظ الباحث العلمي من Google (37) أن القنوات الأيونية من الأغشية الهدبية المعاد تشكيلها للظهارة الشمية Rana catesbeiana حساسة للتركيزات النانومولية للروابط العطرية. قد يكون هذا أحد العروض الأولى للقنوات الوظيفية من نوع مستقبلات الفانيليا TRP في الأهداب. نشطت الأمبير الحلقي قنوات الكاتيون 23 - pS في أهداب الشم الفقارية (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995; 269: C1235 - C1244Crossref PubMed Google Scholar) وقام بتضمين قناة K+ عالية الموصلية، وعرض العديد من الركائز المفتوحة مع موصلات 34 و 80 و 130 pS (24Jorquera O. Latorre R. Labarca P. Am. J. Physiol. 1995; 269: C1235 - C1244Crossref PubMed Google Scholar)، والتي تذكرنا بشدة بوظيفة PC2 (21González - Perrett S. Kim K. Ibarra C. Damiano A.E. Zotta E. Batelli M. Harris P.C. Reisin I.L. Arnaout M.A. Cantiello HF Proc. Ntal. Acad. Sci. U. S. A. 2001 ؛ 98: 1182-1187 Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar). كما تم تحديد وجود قنوات كلوريد 8 pS التي يتم تنشيطها بواسطة cAMP من خلال تحليل ضوضاء الحالة المستقرة للتيارات المستحثة بالروابط (36Larsson H.P. Kleene S.J. Lecar H. Biophys. J. 1997; 72: 1193-1203 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (47) الباحث العلمي من Google). تحتوي أغشية الأهداب الحسية أيضًا على قنوات إينوسيتول ثلاثية الفوسفات (37Honda E. Teeter J.H. Restrepo D. Brain Res. 1995; 703: 79-85 Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). في تلك الدراسة، لوحظ نوعان من قنوات الكاتيون غير الانتقائية من خلال التقلبات الحالية في أغشية أهداب الفئران الشمية المندمجة في الطبقات الثنائية الفوسفورية. تم الحصول على المعلومات الكهربائية المباشرة من الأهداب الحسية في الموقع من قبل Frings و Lindemann (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990 ؛ 57: 1091-1094 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (31) الباحث العلمي من Google)، الذي أجرى دراسات متطلبة للغاية لتحديد الخصائص الفيزيائية الحيوية وتنظيم الموصلات الأيونية في الأهداب من المصباح الشمي للضفدع. تمكن المؤلفون من سحب الأهداب الحسية من خلايا المستقبلات الشمية إلى ماصة التصحيح. على الرغم من حقيقة أن الماصة لم تشكل مانع تسرب كهربائي محكم مع الغشاء الهدبي، فقد تم جمع تيارات قياسية عابرة مدفوعة بجهد الفعل الناشئ عن العصبون الشمي. باستخدام هذه الطريقة، تم الحصول على عتبات الرائحة في نطاق بيكومولار (19Frings S. Lindemann B. Biophys. J. 1990 ؛ 57: 1091-1094 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (31) الباحث العلمي من Google)، مما يشير إلى أن تقارب الترابط أعلى بكثير في الموقع من المستحضرات المعاد تشكيلها. تشير هذه النتيجة أيضًا إلى أن هذه التجارب، مهما كانت صعبة، قد توفر معلومات أكثر موثوقية غير متوفرة بطرق أخرى (28Frings S. Lindemann BJ Gen. Physiol. 1991; 97: 1-16 Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 38Frings S. Benz S. Lindemann B. J. Gen. Physiol. 1991 ؛ 97: 725-747 Crossref PubMed Scopus (36) الباحث العلمي من Google). تشير الأدلة المشمولة إلى وفرة القنوات الأيونية في الأهداب الحسية. كما تم العثور على العديد من مستقبلات البروتين G، بما في ذلك مستقبلات السوماتوستاتين والسيروتونين في الأهداب الأولية للخلايا العصبية في الدماغ (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann - Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999 ؛ 89: 909-926 Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar، 14Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000 ؛ 872: 271-275 Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). وبالتالي فإن الوظيفة الحسية في الأهداب ترتبط ارتباطًا جوهريًا بوجود قنوات وظيفية في هذه الأغشية. حتى الآن، لا تتوفر معلومات عن مستقبلات الغشاء و/أو نشاط القناة الأيونية في الأهداب الأولية من الخلايا الظهارية الكلوية. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن المنتجات الجينية لمرض الكلى متعدد الكيسات السائدة الجسمية PC1 و PC2، وهي عضو جديد في قناة TRP (TRPP2)، موجودة في الأهداب الأولية للخلايا الظهارية الكلوية (7Yoder B.K. Hou X. Guay - Woodford LMJ Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 2508-2516 Crossref PubMed Scopus (709) Google Scholar, 9Pazour G.J. San Agustin J.T. Follit J.A. Rosenbaum J.L. Witman G.B. Curr. Biol. 2002; 12: R378 - R380Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar, 15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003 ؛ 33: 129-137 Crossref PubMed Scopus (1585) الباحث العلمي من Google). قد يبدو التفاعل الوظيفي بين الاثنين أساسيًا لأحداث إشارات الخلايا البيئية التي تؤدي إلى تنظيم نقل Ca2 + وإشارات الخلايا اللاحقة (15Nauli S.M. Alenghat F.J. Luo Y. Williams E. Vassilev P. Li X. Elia A.E.H. Lu W. Brown E.M. Quinn S.J. Ingber D.E. Zhou J. Nat. Genet. 2003 ؛ 33: 129-137 Crossref PubMed Scopus (1585) الباحث العلمي من Google). في هذه الدراسة، وصفنا طريقة للحصول على بيانات قناة واحدة من الأهداب الأولية المعزولة وقدمنا أول دليل مباشر على وجود قنوات وظيفية في الغشاء المغلف للأهداب الأولية للخلايا الظهارية الكلوية. لوحظت ثلاثة أنماط ظاهرية لقناة انتقائية للكاتيونات على الأقل، على الرغم من أن القناة الانتقائية للكاتيونات 80 - pS قد تكون حالة الموصلية الفرعية الأكثر انتشارًا لقناة كبيرة كما لوحظ في كل من البقع الهدبية والأغشية المعاد تكوينها. تتفق البيانات الحالية مع وجود نشاط قناة من نوع TRP في الأهداب الأولية من الخلايا الظهارية الكلوية. قد تكمن القدرة على تصحيح وتحديد التيارات أحادية القناة في هذه العضيات الضيقة في حقيقة أن عملية العزل تضخم الأهداب إلى أبعاد حيث تكون مساحة الغشاء كبيرة بما يكفي للتفاعل مع ماصة التصحيح. قد تساعد قناة الكاتيون في الأهداب الأولية للخلايا الظهارية الكلوية في الحفاظ على هذه الحجرة خالية من الاستقطاب فيما يتعلق بسيتوبلازم الخلية، كما هو موضح في النموذج الافتراضي للوظيفة الهدبية (الشكل 4 ج). يتوافق وجود استجابة المخيم مع وجود بروتين قناة الصوديوم ألفا الظهاري المنظم المعتمد على المخيم في هذه العضيات. ويتفق هذا أيضًا مع البيانات التي تم الحصول عليها من الأهداب الحسية المثبتة بالجهد (36Larsson H.P. Kleene S.J. Lecar H. Biophys. J. 1997; 72: 1193-1203Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (47) Google Scholar) ومستقبلات البروتين G الموجودة، مثل مستقبلات السوماتوستاتين والسيروتونين في أهداب الخلايا العصبية في الدماغ (13Handel M. Schulz S. Stanarius A. Schreff M. Erdtmann - Vourliotis H. Schmidt H. Wolf G. Hollt V. Neuroscience. 1999 ؛ 89: 909-926 Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar، 14Brailov I. Bancila M. Brisorgueil M. Miquel M. Hamon M. Verge D. Brain Res. 2000 ؛ 872: 271-275 Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). وبالتالي، فإن نشاط قناة الكاتيون الجوهري العالي في الأهداب الأولية غير المتحركة للخلايا الظهارية الكلوية قد يساهم في الخصائص الحسية لهذه العضيات. نشكر ماريا ديل روسيو كانتيرو، وجيمينا سيمبرين، وغوستافو تيمبانارو، والدكتورة ماريسا ريبيتو على الدعم الفني الممتاز. نحن ممتنون أيضًا للدكتور دينيس براون، للتدقيق النقدي للمخطوطة والاقتراحات الفنية الخبيرة. يتلقى المرفق الأساسي للمجهر التابع لبرنامج MGH في بيولوجيا الغشاء دعمًا إضافيًا من مركز أبحاث السكري والغدد الصماء في منطقة بوسطن ومركز دراسة أمراض الأمعاء الالتهابية.