Role for carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) in high glucose-mediated repression of long noncoding RNA Tug1

Il a été démontré que les longs ARN non codants (lncRNA) jouent des rôles clés dans une variété d'activités biologiques de la cellule. Cependant, on en sait moins sur la façon dont les lncRNA répondent aux signaux environnementaux et sur les mécanismes transcriptionnels qui régulent leur expression. Des études de notre laboratoire ont montré que l'ARNlnc Tug1 (gène 1 régulé à la hausse par la taurine) est crucial pour la progression de la maladie rénale diabétique, une complication microvasculaire majeure du diabète. En utilisant une combinaison de marquage de proximité avec la peroxydase d'ascorbate de soja modifiée (APEX2), la ChIP-qPCR, le tirage d'oligonucléotides marqués à la biotine et les dosages classiques de la luciférase promotrice dans les podocytes rénaux, nous étendons nos observations initiales dans la présente étude et fournissons maintenant une analyse détaillée sur la façon dont un milieu riche en glucose régule négativement l'expression de Tug1 dans les podocytes. Nos résultats ont révélé un rôle essentiel pour la protéine de liaison à l'élément de réponse aux glucides du facteur de transcription (ChREBP) dans le contrôle de la transcription de Tug1 dans les podocytes en réponse à une augmentation des taux de glucose. Avec ChREBP, d'autres corégulateurs, y compris la protéine de dimérisation MAX (MLX), la protéine de dimérisation MAX 1 (MXD1) et l'histone désacétylase 1 (HDAC1), ont été enrichis au niveau du promoteur Tug1 dans des conditions de glucose élevé. Ces observations fournissent la première caractérisation de la réponse du promoteur Tug1 de la souris au milieu riche en glucose. Nos résultats illustrent un mécanisme moléculaire par lequel ChREBP peut coordonner l'homéostasie du glucose avec l'expression de lncRNA Tug1 et approfondissent notre compréhension de la régulation transcriptionnelle dynamique des lncRNA dans un état pathologique. Il a été démontré que les longs ARN non codants (lncRNA) jouent des rôles clés dans une variété d'activités biologiques de la cellule. Cependant, on en sait moins sur la façon dont les lncRNA répondent aux signaux environnementaux et sur les mécanismes transcriptionnels qui régulent leur expression. Des études de notre laboratoire ont montré que l'ARNlnc Tug1 (gène 1 régulé à la hausse par la taurine) est crucial pour la progression de la maladie rénale diabétique, une complication microvasculaire majeure du diabète. En utilisant une combinaison de marquage de proximité avec la peroxydase d'ascorbate de soja modifiée (APEX2), la ChIP-qPCR, le tirage d'oligonucléotides marqués à la biotine et les dosages classiques de la luciférase promotrice dans les podocytes rénaux, nous étendons nos observations initiales dans la présente étude et fournissons maintenant une analyse détaillée sur la façon dont un milieu riche en glucose régule à la baisse l'expression de Tug1 dans les podocytes. Nos résultats ont révélé un rôle essentiel pour la protéine de liaison à l'élément de réponse aux glucides du facteur de transcription (ChREBP) dans le contrôle de la transcription de Tug1 dans les podocytes en réponse à une augmentation des taux de glucose. Avec ChREBP, d'autres corégulateurs, y compris la protéine de dimérisation MAX (MLX), la protéine de dimérisation MAX 1 (MXD1) et l'histone désacétylase 1 (HDAC1), ont été enrichis au niveau du promoteur Tug1 dans des conditions de glucose élevé. Ces observations fournissent la première caractérisation de la réponse du promoteur Tug1 de la souris au milieu riche en glucose. Nos résultats illustrent un mécanisme moléculaire par lequel ChREBP peut coordonner l'homéostasie du glucose avec l'expression de lncRNA Tug1 et approfondissent notre compréhension de la régulation transcriptionnelle dynamique des lncRNA dans un état pathologique. Les longs ARN non codants (lncRNA) sont classiquement connus sous le nom de divers transcrits d'ARN qui ont plus de 200 nucléotides de long et ne sont pas traduits en protéines ou codent pour des peptides très courts (1Ransohoff J.D. Wei Y. Khavari P.A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018 ; 19 (29138516) : 143-15710.1038/nrm.2017.104Crossref PubMed Scopus (367) Google Scholar, 2Ulitsky I. Bartel D.P. lincRNAs : genomics, evolution, and mechanisms.Cell. 2013 ; 154 (23827673) : 26-4610.1016/j.cell.2013.06.020Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1593) Google Scholar). Les progrès récents dans le séquençage de l'ADN à haut débit et les études RNA-Seq unicellulaires ont révélé que les lncRNA ont des rôles cruciaux dans la régulation de l'expression des gènes et jouent de larges rôles ayant un impact sur la physiologie et la physiopathologie humaines (1Ransohoff J.D. Wei Y. Khavari P.A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018 ; 19 (29138516) : 143-15710.1038/nrm.2017.104Crossref PubMed Scopus (367) Google Scholar, 3Kopp F. Mendell J.T. La classification fonctionnelle et la dissection expérimentale de longs ARN non codants.Cell. 2018 ; 172 (29373828) : 393-40710.1016/j.cell.2018.01.011Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1097) Google Scholar), malgré la prévalence frappante des ARNnc et les innombrables tentatives d'explorer leur fonction, le paysage fonctionnel de la majorité des ARNnc reste insaisissable (3Kopp F. Mendell J.T. Classification fonctionnelle et dissection expérimentale de longs ARN non codants.Cell. 2018 ; 172 (29373828) : 393-40710.1016/j.cell.2018.01.011Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1097) Google Scholar, 4Zhao Y. Li H. Fang S. Kang Y. Y. Wu Hao Y. Z. Li D. Sun Buang Zhang M.Q. Chen NCODE 2016 : une source informative et précieuse de données non codantes de longue durée sur les acides nucléiques de RNA (2016) ; 265867 (4439982020-Drgreff) 3712129 (3712) Google Scholar Schopt. De plus en plus de preuves suggèrent que les lncRNA jouent un rôle clé dans le lien entre l'état métabolique de la cellule, les signaux extracellulaires et la disponibilité des nutriments. Par exemple, nous avons récemment montré que le lncRNA Tug1 est régulé à la baisse dans les podocytes de souris diabétiques et joue un rôle important dans la progression de la néphropathie diabétique (6Long J. Badal S.S. Ye Z. Wang Y. Ayanga B.A. Galvan D.L. Green N.H. Chang B.H. Overbeek P.A. Danesh F.R. Long noncoding RNA Tug1 regulates mitochondrial bioenergetics in diabetic nephropathy.J. Clin. Investig. 2016 ; 126 (27760051) : 4205-421810.1172/JCI87927Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar). Mécaniquement, nous avons constaté que Tug1 régule l'expression de PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α), un régulateur principal de la transcription de la biogenèse mitochondriale, dans des conditions de stress à haute teneur en glucose (HG) en se liant à une région amplificatrice située à 400 kb en amont du gène PGC-1α, servant de pont reliant l'élément cis et le facteur trans pour l'expression de cet important régulateur principal mitochondrial. Cependant, malgré de nombreux progrès dans l'identification de la portée biologique et de la fonction de Tug1, notre compréhension actuelle de la régulation précise de Tug1 et de ses mécanismes de régulation transcriptionnelle en amont reste très limitée. lncRNAs are often expressed in tissue- and/or development-specific patterns (7Washietl S. Kellis M. Garber M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals.Genome Res. 2014 ; 24 (24429298) : 616-62810.1101/gr.165035.113Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 8Mattioli K. Volders P.J. Gerhardinger C. Lee J.C. Maass P.G. Mele M. Rinn J.L. High-throughput functional analysis of lncRNA core promoters elucidates rules governing tissue specificity.Genome Res. 2019 ; 29 (30683753) : 344-35510.1101/gr.242222.118Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar), suggérant que leur expression est étroitement régulée par un certain nombre de facteurs de transcription bien caractérisés (7Washietl S. Kellis M. Garber M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals.Genome Res. 2014 ; 24 (24429298) : 616-62810.1101/gr.165035.113Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 8Mattioli K. Volders P.J. Gerhardinger C. Lee J.C. Maass P.G. Mele M. Rinn J.L. High-throughput functional analysis of lncRNA core promoters élucide les règles régissant la spécificité tissulaire. Genome Res. 2019 ; 29 (30683753) : 344-35510.1101/gr.242222.118Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar, 9Mele M. Mattioli K. Mallard W. Shechner D.M. Gerhardinger C. Rinn J.L. Chromatin environment, transcriptional regulation, and splicing distinguish lincRNAs and mRNAs.Genome Res. 2017 ; 27 (27927715) : 27-3710.1101/gr.214205.116Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar). Dans cette étude, nous fournissons des preuves solides indiquant que la suppression médiée par HG de l'expression de Tug1 est, au moins en partie, régulée par ChREBP (protéine de liaison de l'élément de réponse aux glucides, également connue sous le nom de MLXIPL, pour Mlx-interacting protein-like), un facteur de transcription majeur sensible au glucose (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. Un facteur de transcription sensible au glucose qui régule le métabolisme des glucides dans le foie.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001 ; 98 (11470916) : 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). Enrichi en tissu adipeux, ChREBP est un facteur de transcription de base de la boucle hélicoïdale et de la fermeture à glissière de leucine qui régule l'homéostasie du glucose et la réponse aux glucides alimentaires (11Abdul-Wahed A. Guilmeau S. Postic C. Sweet seizteenth for ChREBP : established roles and future goals.Cell Metab. 2017 ; 26 (28768172) : 324-34110.1016/j.cmet.2017.07.004Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar, 12Baraille F. Planchais J. Dentin R. Guilmeau S. Postic C. Integration of ChREBP-mediated glucose sensing into whole body metabolism.Physiology. 2015 ; 30 (26525342) : 428-43710.1152/physiol.00016.2015Crossref PubMed Scopus (32) Google Scholar, 13Iizuka K. The transcription factor carbohydrate-response element-binding protein (ChREBP) : A possible link between metabolic disease and cancer.Biochim. Biophys. Acta. 2017 ; 1863 (27919710) : 474-48510.1016/j.bbadis.2016.11.029Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar). En effet, un environnement HG favorise la translocation de ChREBP vers le noyau, conduisant à la formation d'un complexe hétérodimérique avec MLX (Max-like protein X) et se liant aux éléments de réponse glucidique (ChoRE) des gènes cibles de ChREBP dans le noyau (14Ma L. Tsatsos N.G. Towle H.C. Rôle direct de ChREBP·Mlx dans la régulation des gènes hépatiques sensibles au glucose.J. Biol. Chem. 2005 ; 280 (15664996) : 12019-1202710.1074/jbc.M413063200Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 15Stoeckman A.K. Ma L. Towle H.C. Mlx is the functional heteromeric partner of the carbohydrate response element-binding protein in glucose regulation of lipogenic enzyme genes.J. Biol. Chem. 2004 ; 279 (14742444) : 15662-1566910.1074/jbc.M311301200Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (154) Google Scholar, 16Merla G. Howald C. Antonarakis S.E. Reymond A. La localisation subcellulaire de la protéine de liaison ChoRE, codée par le gène 14 de la région critique du syndrome de Williams–Beuren, est régulée par 14-3-3.Hum. Mol. Genet. 2004 ; 13 (15163635) : 1505-151410.1093/hmg/ddh163Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar). Dans la présente étude, nous montrons qu'en réponse à HG milieu, ChREBP peut recruter d'autres membres du réseau ChREBP, notamment MLX, MAX (Myc-associated factor), MXD1 (Max dimerization protein 1) et HDAC1 (histone deacetylase 1), à un élément ChoRE et à une E-box voisine (enhancer box) dans le promoteur Tug1, supprimant l'activité transcriptionnelle. Le gène humain lncRNA TUG1 (séquence de référence NCBI NR_110492 transcript variant 1) est situé sur le chromosome 22q12.2 et a 8 transcrits variants, allant de 5,2 à 7,6 kilobases de longueur, tandis que le locus murin Tug1 lncRNA est situé sur le chromosome 11 et a trois transcrits variants (a, b et c) qui sont de 4,1 à 6,7 kilobases de longueur (Fig. 1A). Le promoteur Tug1 a une activité transcriptionnelle in vitro dans les deux orientations et agit également comme un promoteur bidirectionnel entraînant l'expression du gène codant pour les protéines Morc2a (4Zhao Y. Li H. Fang S. Kang Y. Wu W. Hao Y. Li Z. Bu D. Sun N. Zhang M.Q. Chen R. NONCODE 2016 : AN informative and valuable data source of long non-coding RNAs.Nucleic Acids Res. 2016 ; 44 (26586799) : D203-D20810.1093/nar/gkv1252Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar, 17Derrien T. Johnson R. Bussotti G. Tanzer A. Djebali S. Tilgner H. Guernec G. Martin D. Merkel A. Knowles D.G. Lagarde J. Veeravalli L. Ruan X. Ruan Y. Lassmann T. et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs : analysis of their gene structure, evolution, and expression.Genome Res. 2012 ; 22 (22955988) : 1775-178910.1101/gr.1321.11159CrossMrefed Scopus (3082) Google Scholar 18Sigova A.A. Mull A.C. Mullen A.A. M. Orta Gupolin D.G. Almherland Ala. C. Linis C. Sharpada C. Natl. Acad. Sci. U S A. 2013 ; 110 (23382218) : 2876-288110.1073/pnas.1221904110Crossref PubMed Scopus (307) Google Scholar). Conformément à une caractéristique classique des promoteurs bidirectionnels, où les sites de début de transcription (TSS) des deux gènes sont séparés de manière prévisible de moins de 1 kb, le TSS Morc2a n'est séparé que de 374 pb du TSS Tug1. Il est important de noter que le Tug1 est très conservé parmi les espèces et montre un large modèle d'expression tissulaire chez la souris, le rat et l'homme (Fig. 1B) (4Zhao Y. Li H. Fang S. Kang Y. Wu W. Hao Y. Li Z. Bu D. Sun N. Zhang M.Q. Chen R. NONCODE 2016 : an informative and valuable data source of long non-coding RNAs.Nucleic Acids Res. 2016 ; 44 (26586799) : D203-D20810.1093/nar/gkv1252Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar, 19Fagerberg L. Hallström B.M. Oksvold P. Kampf C. Djureinovic D. Odeberg J. Habuka M. Tahmasebpoor S. Danielsson A. Edlund K. Asplund A. Sjöstedt E. Lundberg E. Szigyarto C.A.-K. Skogs M. et al.Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.Mol. Cell. Proteomics. 2014 ; 13 (24309898) : 397-40610.1074/mcp.M113.035600Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1405) Google Scholar). De plus, le locus Tug1 est enrichi de caractéristiques clés de la transcription active, telles que des régions de chromatine ouvertes hébergeant des facteurs de transcription et des modifications des histones, y compris la 4-triméthylation de la lysine H3 (H3K4me3) et H3K36me3 (Fig. 1A), suggérant une transcription active le long du corps du gène Tug1. Auparavant, nous avions identifié Tug1 comme un ARNnc qui est régulé à la baisse dans le milieu diabétique en utilisant une analyse de séquençage d'ARN non biaisée (ARN-Seq) des glomérules rénaux (6Long J. Badal S.S. Ye Z. Wang Y. Ayanga B.A. Galvan D.L. Green N.H. Chang B.H. Overbeek P.A. Danesh F.R. Long noncoding RNA Tug1 regulates mitochondrial bioenergetics in diabetic nephropathy.J. Clin. Investig. 2016 ; 126 (27760051) : 4205-421810.1172/JCI87927Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar). Ici, nous avons développé nos observations précédentes, en trouvant une expression significativement réduite de Tug1 dans plusieurs lignées de cellules rénales qui ont été cultivées dans des conditions HG, y compris les podocytes (Fig. 1C), cellules tubulaires TCMK-1 (Fig. 1D), et des cellules HeLa (Fig. 1E). Notamment, les trois isoformes des transcrits Tug1 ont été régulées à la baisse dans des conditions de HG dans les podocytes (Fig. S1). Nous avons également validé que les podocytes isolés à partir de reins de souris déficientes en récepteurs de la leptine (db/db), un modèle établi de diabète de type 2, présentaient une régulation négative significative de l'expression de Tug1 par rapport aux podocytes obtenus à partir de souris témoins non diabétiques (db/m) (Fig. 1F). Nous avons ensuite soutenu que la régulation négative de Tug1 pourrait être due à une diminution de l'activité transcriptionnelle ou à une dégradation accrue de l'ARN dans des conditions de glucose élevé. Par conséquent, nous avons surveillé l'abondance de l'ARN Tug1 par RT-PCR quantitative en présence d'actinomycine D, qui s'intercale dans l'ADN, formant un complexe stable et inhibant ainsi la nouvelle transcription de l'ARN (Fig. 1G). Nous avons constaté que le taux de dégradation de l'ARN n'était pas significativement différent entre les cellules cultivées dans des conditions HG ou NG. Ce résultat suggère que le taux de dégradation de Tug1 était similaire dans les podocytes, qu'ils soient cultivés dans des conditions HG ou NG, et indique que la régulation négative de Tug1 médiée par HG était principalement due à sa régulation transcriptionnelle. Étant donné que les résultats précédents avaient suggéré que le promoteur Tug1 agissait comme un promoteur bidirectionnel entraînant l'expression de Morc2a, nous avons également déterminé si HG avait le même effet sur l'expression de Morc2a. À cette fin, des podocytes cultivés ont été exposés à HG pendant 24 h ou 48 h (Fig. 1H). Contrairement à son gène voisin Tug1, qui est transcrit dans un brin opposé, nous avons constaté que HG n'inhibait que modestement l'expression de Morc2a à 48 h mais pas à 24 h. D'autre part, le traitement par HG n'a pas eu d'effet significatif sur l'expression de l'ARNm MORC2 dans les cellules HeLa (Fig. 1I). Ces résultats suggèrent que HG n'a pas d'effet cohérent sur l'expression de Morc2a. Pour explorer davantage la façon dont HG régule la transcription de Tug1, nous avons récupéré la région promotrice du gène Tug1 murin pour identifier les sites de liaison potentiels pour les facteurs de transcription. L'alignement des séquences promotrices Tug1 chez la souris, l'homme et le rat a indiqué que ces séquences sont hautement conservées, avec plus de 90% des séquences identiques parmi ces trois espèces (Figs. 2A–C). À l'aide d'un outil Web, rVista 2.0, nous avons identifié plusieurs sites de liaison potentiels pour les facteurs de transcription (Fig. 2B). Notamment, nous avons trouvé plusieurs sites de liaison candidats p53 ainsi que des sites de liaison SP1, YY1, E47, IRF-3 et PPAR-α. Fait important, nous avons également trouvé une séquence de consensus ChoRE dans cette région qui était presque identique chez les trois espèces que nous avons analysées (Fig. 2B et C). La séquence ChoRE correspond bien au motif consensus où deux E-boxes (CAYGYG et CRCRTG) sont séparées par 5 nucléotides (où Y désigne la pyrimidine [C ou T] et R désigne la purine [A ou G]) (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. Un facteur de transcription sensible au glucose qui régule le métabolisme des glucides dans le foie.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001 ; 98 (11470916) : 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 20Jeong Y.S. Kim D. Lee Y.S. Kim H.J. Han J.Y. Im S.S. Chong H.K. Kwon J.K. Cho Y.H. Kim W.K. Osborne T.F. Horton J.D. Jun H.S. Ahn Y.H. Ahn S.M. et al.Integrated expression profiling and genome-wide analysis of ChREBP targets reveals the dual role for ChREBP in glucose-regulated gene expression.PLoS ONE. 2011 ; 6 (21811631) : e2254410.1371/journal.pone.0022544Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar, 21Poungvarin N. Chang B. Imamura M. Chen J. Moolsuwan K. Sae-Lee C. L. Li Chan L. Genome-wide analysis of ChREBP binding sites on male mouse liver and adipose chromatin.Endrinococology 2015 ; 156 (25751637) 1982-1994.1210/en4.2014-166CrossMed Scopus (47) Google Scholar, 22Ma L.M. Robinson L.C. Towsuwn H.P.L. Chem. 2006 ; 281 (16885160) : 28721-2873010.1074/jbc.M601576200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (281) Google Scholar). L'identification de ChoRE comme motif de signature potentiel dans la région était d'un grand intérêt pour nous, car des rapports précédents avaient démontré que ChoRE est reconnu par le facteur de transcription ChREBP, un facteur de transcription clé qui est régulé à la hausse dans des conditions HG (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. A glucose-responsive transcription factor that regulates carbohydrate metabolism in the liver.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001 ; 98 (11470916) : 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 11Abdul-Wahed A. Guilmeau S. Postic C. Sweet seizième pour ChREBP : rôles établis et objectifs futurs.Cell Metab. 2017 ; 26 (28768172) : 324-34110.1016/j.cmet.2017.07.004Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar). Nous avons ensuite examiné si le promoteur Tug1 sert de site de liaison à la ChREBP en tirant parti des données ChIP-Seq (ChIP couplé au séquençage de l'ADN à haut débit) à l'échelle du génome provenant d'une de nos études précédentes sur le tissu adipeux (21Poungvarin N. Chang B. Imamura M. Chen J. Moolsuwan K. Sae-Lee C. Li W. Chan L. Genome-wide analysis of ChREBP binding sites on male mouse liver and white adipose chromatin.Endocrinology. 2015 ; 156 (25751637) : 1982-199410.1210/en.2014-1666Crossref PubMed Scopus (47) Google Scholar). Using model-based analysis of ChIP-Seq (MACS) (23Zhang Y. Liu T. Meyer c.a. Eeckhoute J. Johnson D.S. Bernstein B.E. Nusbaum C. Myers R.M. Brown M. Li W. Liu X.S. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).Genome Biol. 2008 ; 9 (18798982) : R13710.1186/gb-2008-9-9-r137Crossref PubMed Scopus (6659) Google Scholar), nous avons détecté un pic de site de liaison ChREBP à 324 pb en amont du promoteur Tug1 (Fig. 2D). Pour valider mécaniquement la liaison de ChREBP au promoteur de Tug1 dans des conditions HG, nous avons utilisé un test ChIP en incubant des extraits nucléaires de podocytes cultivés sous HG avec un anticorps de lapin contre ChREBP. Comme le montre la Fig. 2E, seul ChREBP-IgG, mais pas l'IgG de lapin témoin, a enrichi l'ADN chromatinien du promoteur Tug1, qui a été détecté par amplification PCR, suggérant que ChREBP se lie effectivement au promoteur Tug1 dans des conditions HG. Pour valider davantage la liaison de ChREBP au promoteur Tug1 dans des cellules vivantes et pour identifier les facteurs de régulation qui pourraient potentiellement former un complexe avec ChREBP pour contrôler l'expression de Tug1 dans des conditions HG, nous avons utilisé une combinaison de ciblage CRISPR et de marquage de proximité avec une technologie d'ascorbate peroxydase modifiée (APEX2) (24Myers S.A. Wright J. Peckner R. Kalish B.T. Zhang F. Carr S.A. Découverte de protéines associées à un locus génomique prédéfini via le marquage de proximité médié par dCas9-APEX.Nat. Methods. 2018 ; 15 (29735997) : 437-43910.1038/s41592-018-0007-1Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 25Lam S.S. Martell J.D. Kamer K.J. Deerinck T.J. Ellisman M.H. Mootha V.K. Ting A.Y. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.Nat. Methods. 2015 ; 12 (25419960) : 51-5410.1038/nmeth.3179Crossref PubMed Scopus (452) Google Scholar, 26Rhee H.W. Zou P. Udeshi N.D. Martell J.D. Mootha V.K. Carr S.A. Ting A.Y. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.Science. 2013 ; 339 (23371551) : 1328-133110.1126/science.1230593Crossref PubMed Scopus (571) Google Scholar). Nous avons conçu un vecteur piggyBac pour exprimer l'ARN guide dirigé par le promoteur de l'ARN U6 (ARNg) qui cible la région du promoteur Tug1 et une construction de fusion Cas9 (dCas9) -APEX2 morte sous un amplificateur/promoteur CMV (27Kaewsapsak P. Shechner D.M. Mallard W. Rinn J.L. Ting A.Y. Live-cell mapping of organelle-associated RNAs via proximity biotinylation combined with protein-RNA crosslinking.Elife. 2017 ; 6 : e2922410.7554/eLife.29224Crossref PubMed Scopus (68) Google Scholar) (voir Fig. S2 pour la conception et la séquence de construction). Nous avons transfecté cette construction avec la transposase piggyBac (28Galvan D.L. Kettlun C.S. Wilson M.H. Targeting piggyBac transposon integrations in the human genome.in : Storici F. Gene Correction : Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ2014: 143-161Crossref Scopus (3) Google Scholar, 29Kahlig K.M. Saridey S.K. Kaja A. Daniels M.A. George Jr., A.L. Wilson M.H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2010 ; 107 (20080581) : 1343-134810.1073/pnas.0910383107Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar) dans les podocytes cultivés. Comme représenté sur la Fig. 2F, l'ARNg dirige la protéine de fusion dCas9-APEX2 vers la région promotrice Tug1. En présence de H2O2, APEX2 oxydera le biotine-phénol en radicaux biotine-phénoxyle (27Kaewsapsak P. Shechner D.M. Mallard W. Rinn J.L. Ting A.Y. Live-cell mapping of organelle-associated RNAs via proximity biotinylation combined with protein-RNA crosslinking.Elife. 2017 ; 6 : e2922410.7554/eLife.29224Crossref PubMed Scopus (68) Google Scholar, 30Han S. Udeshi N.D. Deerinck T.J. Svinkina T. Ellisman M.H. Carr S.A. Ting A.Y. Proximity biotinylation as a method for mapping proteins associated with mtDNA in living cells.Cell Chem. Biol. 2017 ; 24 (28238724) : 404-41410.1016/j.chembiol.2017.02.002Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (52) Google Scholar). Les radicaux biotine-phénoxyle peuvent marquer et se fixer aux protéines voisines (rayon d'environ20 nm) (31Martell J.D. Deerinck T.J. Sancak Y. Poulos T.L. Mootha V.K. Sosinsky G.E. Ellisman M.H. Ting A.Y. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically coded reporter for electron microscopy.Nat. Biotechnol. 2012 ; 30 (23086203) : 1143-114810.1038/nbt.2375Crossref PubMed Scopus (373) Google Scholar). Nous avons utilisé des billes de streptavidine conjuguées magnétiques pour enrichir les protéines biotinylées dans des podocytes cultivés. Comme contrôle, nous avons utilisé des podocytes exprimant dCas9-APEX2 avec un ARNg non ciblant. Nous avons procédé à l'évaluation des protéines biotinylées marquées par dCas9-APEX2 dans la région promotrice Tug1 ciblée par l'ARNg. L'immunoblotting contre ChREBP a montré que ChREBP n'était biotinylée que dans les cellules transduites par l'ARNg ciblé par le promoteur Tug1 mais pas dans les podocytes témoins (Fig. Il est important de noter que nous avons également confirmé que ChREBP est présent au niveau du promoteur Tug1 et que HG augmente sa prévalence (Fig. 2G). Parce que la souris ChREBP a deux variantes de transcription différentes (61Herman M.A. Peroni O.D. Villoria J. Schon M.R. Abumrad N.A. Bluher M. Klein S. Kahn B.B. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic glucose metabolism.Nature. 2012 ; 484 (22466288) : 333-33810.1038/nature10986Crossref PubMed Scopus (361) Google Scholar), ChREBP-α and ChREBP-β (Fig. 3A), nous avons ensuite examiné quelle isoforme est sensible au HG dans la lignée cellulaire podocytaire. En utilisant des amorces quantitatives RT-PCR et spécifiques à l'isoforme, nous avons constaté que seul le transcrit ChREBP-α est régulé à la hausse dans des conditions HG (Fig. 3B). Pour explorer la fonction de ChREBP sur la transcription Tug1 in vitro, nous avons généré une construction d'expression de luciférase pilotée par le promoteur Tug1 de 1 kb et l'avons cotransfectée avec une construction exprimant WT ChREBP-α. Dans le test rapporteur de luciférase, les cellules cultivées transfectées avec un vecteur de contrôle pGL4 avaient des lectures de luciférase négligeables (Fig. 3C), mais le vecteur contenant le promoteur Tug1 de 1 kb a donné une activité luciférase significative. Cette activité promotrice a été supprimée par co-transfection avec la construction d'ADNc ChREBP-α d'une manière dose-dépendante (Fig. 3C), ce qui suggère que ChREBP peut réprimer la transcription de Tug1. En utilisant des dosages de rapporteurs de luciférase dans les podocytes, nous avons également comparé l'effet de deux isoformes de ChREBP sur la transcription de Tug1 et avons constaté que ChREBP-β est beaucoup moins puissant pour réprimer la transcription de Tug1 que ChREBP-α (Fig. S3A). De plus, nous avons trouvé que le facteur de transcription p53 active de manière significative, alors que YY1 réprime, la transcription de Tug1 (Fig. S3B), compatible avec la présence de sites de liaison consensus pour ces facteurs de transcription dans la région promotrice (Fig. 2B) et des rapports antérieurs sur l'induction de l'expression de Tug1 par p53 (32Guttman M. Amit I. Garber M. French C. Lin M.F. Feldser D. Huarte M. Zuk O. Carey B.W. Cassady J.P. Cabili M.N. Jaenisch R. Mikkelsen T.S. Jacks T. Hacohen N. et al.Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals.Nature. 2009 ; 458 (19182780) : 223-22710.1038/nature07672Crossref PubMed Scopus (2941) Google Scholar, 33Khalil A.M. Guttman M. Huarte M. Garber M. Raj A. Rivea Morales D. Thomas K. Presser A. Bernstein B.E. van Oudenaarden A. Regev A. Lander E.S. Rinn J.L. Many human large intergenic non-ccoding RNAs associated with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009 ; 106 (19571010) : 11667-1167210.1073/pnas.0904715106Crossref PubMed Scopus (2172) Google Scholar). Parce qu'il y a deux ChoRE potentiels présents dans la région promotrice du gène Tug1 murin, nous avons également généré plusieurs constructions mutantes ChoRE où l'espaceur 5-nucléotide (nt) entre les deux motifs de répétition directe (DR1) a été raccourci à 4 nt qui devrait abolir la liaison de ChREBP à ChoRE1 ou ChoRE2 (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. Un facteur de transcription sensible au glucose qui régule le métabolisme des glucides dans le foie.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001 ; 98 (11470916) : 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 34Shih H.M. Liu Z. Towle H.C. Two CACGTG motifs with proper spacing dictate the carbohydrate regulation of hepatic gene transcription.J. Biol. Chem. 1995 ; 270 (7665621) : 21991-2199710.1074/jbc.270.37.21991Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar). Le mutant ChoRE1 (mut1) n'a pas montré de suppression de l'activité du promoteur Tug1 (Fig. 3D). Le double mutant (mut3) dans lequel la délétion d'un seul nucléotide s'est produite dans ChoRE1 et ChoRE2 a montré une activité promotrice similaire à celle du mutant ChoRE1. En revanche, le mutant ChoRE2 (mut2) a montré le même niveau d'activité de promoteur que le WT (Fig. 3D). Ces résultats indiquent que ChoRE1, mais pas ChoRE2, joue un rôle important dans la répression médiée par ChREBP de l'expression de Tug1. Nous avons en outre utilisé des approches de perte de fonction et de gain de fonction pour examiner le rôle de ChREBP dans la régulation transcriptionnelle du gène Tug1. Nous avons d'abord détruit l'expression de ChREBP par l'ARNsh dans les podocytes (Fig. 3E). Conformément à nos observations précédentes, nous avons constaté que l'inactivation de ChREBP entraînait une expression accrue de Tug1 et de son gène cible en aval, Pgc1α. L'efficacité de démontage a été démontrée par Western blotting (Fig. 3E). Inversement, la surexpression de ChREBP a conduit à la répression des gènes Tug1 et Pgc1α (Fig. 3F). Ces résultats suggèrent que lncRNA Tug1 est un gène cible du facteur de transcription ChREBP. ChREBP est connu pour se lier au ChoRE avec un autre facteur de transcription, MLX, un partenaire obligé de ChREBP, formant un hétérodimère (14Ma L. Tsatsos N.G. Towle H.C. Rôle direct de ChREBP·Mlx dans la régulation des gènes hépatiques sensibles au glucose.J. Biol. Chem. 2005 ; 280 (15664996) : 12019-1202710.1074/jbc.M413063200Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 15Stoeckman A.K. Ma L. Towle H.C. Mlx is t
Se ha demostrado que los ARN no codificantes largos (lncRNA) desempeñan funciones clave en una variedad de actividades biológicas de la célula. Sin embargo, se sabe menos sobre cómo los lncRNA responden a las señales ambientales y qué mecanismos transcripcionales regulan su expresión. Los estudios de nuestro laboratorio han demostrado que el ARNInc Tug1 (gen 1 regulado positivamente por la taurina) es crucial para la progresión de la enfermedad renal diabética, una complicación microvascular importante de la diabetes. Usando una combinación de marcado de proximidad con la ascorbato peroxidasa de soja modificada (APEX2), ChIP-qPCR, extracción de oligonucleótidos marcados con biotina y ensayos clásicos de luciferasa promotora en podocitos renales, ampliamos nuestros resultados iniciales en el estudio actual y ahora proporcionamos un análisis detallado sobre cómo el medio con alto contenido de glucosa regula a la baja la expresión de Tug1 en los podocitos. Nuestros resultados revelaron un papel esencial para la proteína de unión al elemento de respuesta a carbohidratos del factor de transcripción (ChREBP) en el control de la transcripción de Tug1 en los podocitos en respuesta al aumento de los niveles de glucosa. Junto con ChREBP, otros correguladores, incluyendo la proteína de dimerización MÁXIMA (MLX), la proteína de dimerización MÁXIMA 1 (MXD1) y la histona desacetilasa 1 (HDAC1), se enriquecieron en el promotor Tug1 en condiciones de alto contenido de glucosa. Estas observaciones proporcionan la primera caracterización de la respuesta del promotor Tug1 de ratón al medio con alto contenido de glucosa. Nuestros hallazgos ilustran un mecanismo molecular mediante el cual ChREBP puede coordinar la homeostasis de la glucosa con la expresión del ARNlnc Tug1 y ampliar nuestra comprensión de la regulación transcripcional dinámica de los ARNlnc en un estado de enfermedad. Se ha demostrado que los ARN no codificantes largos (lncRNA) desempeñan funciones clave en una variedad de actividades biológicas de la célula. Sin embargo, se sabe menos sobre cómo los lncRNA responden a las señales ambientales y qué mecanismos transcripcionales regulan su expresión. Los estudios de nuestro laboratorio han demostrado que el ARNInc Tug1 (gen 1 regulado positivamente por taurina) es crucial para la progresión de la enfermedad renal diabética, una complicación microvascular importante de la diabetes. Usando una combinación de marcado de proximidad con la ascorbato peroxidasa de soja modificada (APEX2), ChIP-qPCR, extracción de oligonucleótidos marcados con biotina y ensayos clásicos de luciferasa promotora en podocitos renales, ampliamos nuestros resultados iniciales en el estudio actual y ahora proporcionamos un análisis detallado sobre cómo el medio con alto contenido de glucosa regula a la baja la expresión de Tug1 en los podocitos. Nuestros resultados revelaron un papel esencial para la proteína de unión al elemento de respuesta a carbohidratos del factor de transcripción (ChREBP) en el control de la transcripción de Tug1 en los podocitos en respuesta al aumento de los niveles de glucosa. Junto con ChREBP, otros correguladores, incluyendo la proteína de dimerización MÁXIMA (MLX), la proteína de dimerización MÁXIMA 1 (MXD1) y la histona desacetilasa 1 (HDAC1), se enriquecieron en el promotor Tug1 en condiciones de alto contenido de glucosa. Estas observaciones proporcionan la primera caracterización de la respuesta del promotor Tug1 de ratón al medio con alto contenido de glucosa. Nuestros hallazgos ilustran un mecanismo molecular mediante el cual ChREBP puede coordinar la homeostasis de la glucosa con la expresión del ARNlnc Tug1 y ampliar nuestra comprensión de la regulación transcripcional dinámica de los ARNlnc en un estado de enfermedad. Los ARN no codificantes largos (lncRNA) se conocen clásicamente como transcritos de ARN diversos que tienen más de 200 nucleótidos de longitud y no se traducen en proteínas o codifican péptidos muy cortos (1Ransohoff J.D. Wei Y. Khavari P.A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018; 19 (29138516): 143-15710.1038/nrm.2017.104Crossref PubMed Scopus (367) Google Scholar, 2Ulitsky I. Bartel D.P. lincRNAs: genomics, evolution, and mechanisms.Cell. 2013; 154 (23827673): 26-4610.1016/j.cell.2013.06.020Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1593) Google Scholar). Los avances recientes en la secuenciación de ADN de alto rendimiento y los estudios de ARN-Seq unicelular han revelado que los ARNnc tienen funciones cruciales en la regulación de la expresión génica y desempeñan funciones amplias que afectan la fisiología y la fisiopatología humanas (1Ransohoff J.D. Wei Y. Khavari P.A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018; 19 (29138516): 143-15710.1038/nrm.2017.104Crossref PubMed Scopus (367) Google Scholar, 3Kopp F. Mendell J.T. Functional classification and experimental dissection of long noncoding RNAs.Cell. 2018; 172 (29373828): 393-40710.1016/j.cell.2018.01.011Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1097) Google Scholar), sin embargo, a pesar de la sorprendente prevalencia de los ARNnc e innumerables intentos de explorar su función, el paisaje funcional de la mayoría de los ARNnc sigue siendo elusivo (3Kopp F. Mendell J.T. Functional classification and experimental dissection of long noncoding RNAs.Cell. 2018; 172 (29373828): 393-40710.1016/j.cell.2018.01.011Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1097) Google Scholar, 4Zhao Y. H. Li Fang S. Kang Y. W. Wu Hao Y. Li. D. D. Sun N. Zhang M.Q. Chen R. NONCO 2016: una fuente informativa y valiosa de datos no codificantes de ARNnucleico. Acids. 2016; (26599820820) PubMed Scopus (37720) Pubent52 (37712) Pubented Scholar (3Kopp F. Mendell J.T. Scholar). La creciente evidencia sugiere que los lncRNA desempeñan un papel clave en la vinculación del estado metabólico de la célula con las señales extracelulares y la disponibilidad de nutrientes. Por ejemplo, recientemente hemos demostrado que el ARNlnc Tug1 está regulado negativamente en los podocitos de ratones diabéticos y desempeña un papel importante en la progresión de la nefropatía diabética (6Long J. Badal S.S. Ye Z. Wang Y. Ayanga B.A. Galvan D.L. Green N.H. Chang B.H. Overbeek P.A. Danesh F.R. Long noncoding RNA Tug1 regula la bioenergética mitocondrial en la nefropatía diabética.J. Clin. Investig. 2016; 126 (27760051): 4205-421810.1172/JCI87927Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar). Mecánicamente, encontramos que Tug1 regula la expresión de PGC-1α (coactivador gamma del receptor activado por el proliferador de peroxisomas 1α), un regulador maestro de la transcripción de la biogénesis mitocondrial, en condiciones de estrés con alto contenido de glucosa (HG) al unirse a una región potenciadora que está 400 kb aguas arriba del gen PGC-1α, sirviendo como un puente que conecta el elemento cis y el factor trans para la expresión de este importante regulador maestro mitocondrial. Sin embargo, a pesar de mucho progreso en la identificación del alcance biológico y la función de Tug1, nuestra comprensión actual de la regulación precisa de Tug1 y sus mecanismos reguladores transcripcionales aguas arriba sigue siendo muy limitada. Los lncRNA a menudo se expresan en patrones específicos de tejido y/o desarrollo (7Washietl S. Kellis M. Garber M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals.Genome Res. 2014; 24 (24429298): 616-62810.1101/gr.165035.113Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 8Mattioli K. Volders P.J. Gerhardinger C. Lee J.C. Maass P.G. Mele M. Rinn J.L. High-throughput functional analysis of lncRNA core promoters elucidates rules governing tissue specificity.Genome Res. 2019; 29 (30683753): 344-35510.1101/gr.242222.118Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar), sugiriendo que su expresión está estrechamente regulada por una serie de factores de transcripción bien caracterizados (7Washietl S. Kellis M. Garber M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals.Genome Res. 2014; 24 (24429298): 616-62810.1101/gr.165035.113Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 8Mattioli K. Volders P.J. Gerhardinger C. J.C. Maass P.G. Mele M. Rinn J.L. High-throughput functional analysis of lncRNA core promoters elucidates rules governing tissue specificity.Genome Res. 2019; 29 (30683753): 344-35510.1101/gr.242222.118Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar, 9Mele M. Mattioli K. Mallard W. Shechner D.M. Gerhardinger C. Rinn J.L. Chromatin environment, transcriptional regulation, and splicing distinguish lincRNAs and mRNAs.Genome Res. 2017; 27 (27927715): 27-3710.1101/gr.214205.116Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar). En este estudio, proporcionamos evidencia sólida que indica que la supresión mediada por HG de la expresión de Tug1 está, al menos en parte, regulada por ChREBP (proteína de unión al elemento de respuesta a los carbohidratos, también conocida como MLXIPL, por Mlx-interacting protein-like), un factor de transcripción importante sensible a la glucosa (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. Un factor de transcripción sensible a la glucosa que regula el metabolismo de los carbohidratos en el hígado.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001; 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). Enriquecido en tejido adiposo, ChREBP es un factor de transcripción básico de la cremallera de leucina de hélice-bucle-hélice que regula la homeostasis de la glucosa y la respuesta a los carbohidratos de la dieta (11Abdul-Wahed A. Guilmeau S. Postic C. Sweet decimosexto para ChREBP: roles establecidos y objetivos futuros. Cell Metab. 2017; 26 (28768172): 324-34110.1016/j.cmet.2017.07.004Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar, 12Baraille F. Planchais J. Dentin R. Guilmeau S. Postic C. Integration of ChREBP-mediated glucose sensing into whole body metabolism.Physiology. 2015; 30 (26525342): 428-43710.1152/physiol.00016.2015Crossref PubMed Scopus (32) Google Scholar, 13Iizuka K. The transcription factor carbohydrate-response element-binding protein (ChREBP): A possible link between metabolic disease and cancer.Biochim. Biophys. Acta. 2017; 1863 (27919710): 474-48510.1016/j.bbadis.2016.11.029Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar). De hecho, un entorno de HG promueve la translocación de ChREBP al núcleo, lo que conduce a la formación de un complejo heterodimérico con MLX (proteína X similar a Max) y la unión a los elementos de respuesta a carbohidratos (ChoRE) de los genes diana de ChREBP en el núcleo (14Ma L. Tsatsos N.G. Towle H.C. Direct role of ChREBP·Mlx in regulation hepatic glucose-responsive genes.J. Biol. Chem. 2005; 280 (15664996): 12019-1202710.1074/jbc.M413063200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 15Stoeckman A.K. Ma L. Towle H.C. Mlx is the functional heteromer partner of the carbohydrate response element-binding protein in glucose regulation of lipogenic enzyme genes.J. Biol. Chem. 2004; 279 (14742444): 15662-1566910.1074/jbc.M311301200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (154) Google Scholar, 16Merla G. Howald C. Antonarakis S.E. Reymond A. La localización subcelular de la proteína de unión a ChoRE, codificada por el gen de la región crítica del síndrome de Williams–Beuren 14, está regulada por 14-3-3.Hum. Mol. Genet. 2004; 13 (15163635): 1505-151410.1093/hmg/ddh163Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar). En el estudio actual, mostramos que en respuesta al medio HG, ChREBP puede reclutar a otros miembros de la red ChREBP, incluidos MLX, MAX (factor asociado a Myc), MXD1 (proteína de dimerización Max 1) y HDAC1 (histona desacetilasa 1), a un elemento ChoRE y E-box vecino (caja potenciadora) en el promotor Tug1, suprimiendo la actividad transcripcional. El gen de ARNlnc TUG1 humano (secuencia de referencia de NCBI NR_110492 variante de transcripción 1) se encuentra en el cromosoma 22q12.2 y tiene 8 transcripciones variantes, que varían de 5,2-7,6 kilobases de longitud, mientras que el locus de ARNlnc Tug1 murino se encuentra en el cromosoma 11 y tiene tres transcripciones variantes (a, b y c) que tienen 4,1-6,7 kilobases de longitud (Fig. 1A). El promotor Tug1 tiene actividad transcripcional in vitro en ambas orientaciones y actúa como un promotor bidireccional que impulsa la expresión del gen codificante de proteínas Morc2a también (4Zhao Y. Li H. Fang S. Kang Y. Wu W. Hao Y. Li Z. Bu D. Sun N. Zhang M.Q. Chen R. NONCODE 2016: una fuente de datos informativa y valiosa de ARN largos no codificantes. Nucleic Acids Res. 2016; 44 (26586799): D203-D20810.1093/nar/gkv1252Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar, 17Derrien T. Johnson R. Bussotti G. Tanzer A. Djebali S. Tilgner H. Guernec G. Martin D. Merkel A. Knowles D.G. Lagarde J. Veeravalli L. Ruan X. Ruan Y. Lassmann T. et al.The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.Genome Res. 2012; 22 (22955988): 1775-178910.1101/gr.132159.111CrossCref PubMedopus Scopus (3082) Google Scholar, 18Sigova A.A. Mullen A.C. Molin B.C. Natl. Acad. Sci. U S A. 2013; 110 (23382218): 2876-288110.1073/pnas.1221904110Crossref PubMed Scopus (307) Google Scholar). De acuerdo con una característica clásica de los promotores bidireccionales, donde los sitios de inicio de la transcripción (TSS) de los dos genes están separados de forma predecible por menos de 1 kb, el TSS de Morc2a está separado por solo 374 pb del TSS de Tug1. Es importante destacar que Tug1 está altamente conservado entre las especies y muestra un patrón de expresión tisular amplio en ratones, ratas y humanos (Fig. 1B) (4Zhao Y. Li H. Fang S. Kang Y. Wu W. Hao Y. Li Z. Bu D. Sun N. Zhang M.Q. Chen R. NONCODE 2016: an informative and valuable data source of long non-coding RNAs.Nucleic Acids Res. 2016; 44 (26586799): D203-D20810.1093/nar/gkv1252Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar, 19Fagerberg L. Hallström B.M. Oksvold P. Kampf C. Djureinovic D. Odeberg J. Habuka M. Tahmasebpoor S. Danielsson A. Edlund K. Asplund A. Sjöstedt E. Lundberg E. Szigyarto C.A.-K. Skogs M. et al.Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.Mol. Cell. Proteomics. 2014; 13 (24309898): 397-40610.1074/mcp.M113.035600Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1405) Google Scholar). Además, el locus Tug1 está enriquecido con características clave de la transcripción activa, como regiones de cromatina abierta que albergan factores de transcripción y modificaciones de histonas, incluida la 4-trimetilación de lisina H3 (H3K4me3) y H3K36me3 (Fig. 1A), lo que sugiere una transcripción activa a lo largo del cuerpo del gen Tug1. Anteriormente, habíamos identificado Tug1 como un lncRNA que está regulado negativamente en el medio diabético utilizando un análisis de secuenciación de ARN imparcial (RNA-Seq) de glomérulos renales (6Long J. Badal S.S. Ye Z. Wang Y. Ayanga B.A. Galvan D.L. Green N.H. Chang B.H. Overbeek P.A. Danesh F.R. El ARN no codificante largo Tug1 regula la bioenergética mitocondrial en la nefropatía diabética.J. Clin. Investig. 2016; 126 (27760051): 4205-421810.1172/JCI87927Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar). Aquí, hemos ampliado nuestras observaciones anteriores, encontrando una expresión significativamente reducida de Tug1 en varias líneas celulares de riñón que se cultivaron en condiciones de HG, incluidos los podocitos (Fig. 1C), células tubulares TCMK-1 (Fig. 1D), y células HeLa (Fig. 1E). En particular, las tres isoformas de los transcritos de Tug1 se regularon negativamente en condiciones de HG en podocitos (Fig. S1). También validamos que los podocitos aislados de riñones de ratones deficientes en receptores de leptina (db/db), un modelo establecido de diabetes tipo 2, mostraron una regulación negativa significativa de la expresión de Tug1 en comparación con los podocitos obtenidos de ratones no diabéticos (db/m) de control (Fig. 1F). A continuación, argumentamos que la regulación negativa de Tug1 podría deberse a la disminución de la actividad transcripcional o al aumento de la degradación del ARN en condiciones de alta glucosa. Por lo tanto, monitoreamos la abundancia de ARN de Tug1 mediante RT-PCR cuantitativa en presencia de actinomicina D, que se intercala en el ADN, formando un complejo estable e inhibiendo así la transcripción de nuevo ARN (Fig. 1G). Encontramos que la tasa de degradación del ARN no fue significativamente diferente entre las células cultivadas en condiciones de HG o NG. Este resultado sugiere que la tasa de degradación de Tug1 fue similar en podocitos cultivados en condiciones de HG o NG e indica que la regulación negativa de Tug1 mediada por HG se debió principalmente a su regulación transcripcional. Debido a que los resultados anteriores habían sugerido que el promotor Tug1 actúa como un promotor bidireccional que impulsa la expresión de Morc2a, también determinamos si HG tiene el mismo efecto sobre la expresión de Morc2a. Con este fin, los podocitos cultivados se expusieron a HG durante 24 h o 48 h (Fig. 1H). A diferencia de su gen vecino Tug1, que se transcribe en una cadena opuesta, encontramos que HG solo inhibió modestamente la expresión de Morc2a a las 48 h, pero no a las 24 h. Por otro lado, el tratamiento con HG no tuvo un efecto significativo sobre la expresión de ARNm de MORC2 en células HeLa (Fig. 1I). Estos resultados sugieren que HG no tiene un efecto consistente sobre la expresión de Morc2a. Para explorar más a fondo cómo HG regula la transcripción de Tug1, recuperamos la región promotora del gen Tug1 murino para identificar posibles sitios de unión para los factores de transcripción. La alineación de las secuencias promotoras de Tug1 de ratón, humano y rata indicó que estas secuencias están altamente conservadas, con más del 90% de las secuencias idénticas entre estas tres especies (Figs. 2A-C). Utilizando una herramienta basada en la web, rVista 2.0, identificamos varios sitios de unión potenciales para los factores de transcripción (Fig. 2B). En particular, encontramos múltiples sitios de unión candidatos a p53, así como sitios de unión SP1, YY1, E47, IRF-3 y PPAR-α. Es importante destacar que también encontramos una secuencia consenso de ChoRE en esta región que era casi idéntica en las tres especies que analizamos (Fig. 2B y C). La secuencia ChoRE coincidió bien con el motivo de consenso donde dos cajas E (CAYGYG y CRCRTG) están separadas por 5 nucleótidos (donde Y denota pirimidina [C o T] y R denota purina [A o G]) (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. Un factor de transcripción sensible a la glucosa que regula el metabolismo de los carbohidratos en el hígado.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001; 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 20Jeong Y.S. Kim D. Lee Y.S. Kim H.J. Han J.Y. Im S.S. Chong H.K. Kwon J.K. Cho Y.H. Kim W.K. Osborne T.F. Horton J.D. Jun H.S. Ahn Y.H. Ahn S.M. et al.Integrated expression profiling and genome-wide analysis of ChREBP targets reveals reveals reveals the dual role for ChREBP in glucose-regulated gene expression.PLoS ONE. 2011; 6 (21811631): e2254410.1371/journal.pone.0022544Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar, 21Poungvarin N. Chang B. Imamura M. Chen J. Moolsuwan K. Sae-Lee C. Li W. Chan L. Genome-wide analysis of ChREBP binding sites on male liver and adipose chromatin.Endocrinology. 2015; 156 (25751637): 1982-1994.1210/en.20146CrossM Scoped Scopus (47) Google Scholar 22, L.M. Robinson L.C. Towle L.C. Chem. 2006; 281 (16885160): 28721-2873010.1074/jbc.M601576200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (281) Google Scholar). La identificación de ChoRE como un posible motivo de firma en la región fue de gran interés para nosotros, porque informes anteriores habían demostrado que ChoRE es reconocido por el factor de transcripción ChREBP, un factor de transcripción clave que se regula positivamente en condiciones de HG (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. Un factor de transcripción sensible a la glucosa que regula el metabolismo de los carbohidratos en el hígado.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001; 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 11Abdul-Wahed A. Guilmeau S. Postic C. Sweet sixteenth for ChREBP: established roles and future goals.Cell Metab. 2017; 26 (28768172): 324-34110.1016/j.cmet.2017.07.004Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar). Luego analizamos si el promotor Tug1 sirve como sitio de unión a ChREBP aprovechando los datos de ChIP-Seq (ChIP junto con secuenciación de ADN de alto rendimiento) de todo el genoma de uno de nuestros estudios previos de tejido adiposo (21Poungvarin N. Chang B. Imamura M. Chen J. Moolsuwan K. Sae-Lee C. Li W. Chan L. Genome-wide analysis of ChREBP binding sites on male mouse liver and white adipose chromatin.Endocrinology. 2015; 156 (25751637): 1982-199410.1210/en.2014-1666Crossref PubMed Scopus (47) Google Scholar). Utilizando el análisis basado en modelos de ChIP-Seq (MACS) (23Zhang Y. Liu T. Meyer C.A. Eeckhoute J. Johnson D.S. Bernstein B.E. Nusbaum C. Myers R.M. Brown M. Li W. Liu X.S. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).Genome Biol. 2008; 9 (18798982): R13710.1186/gb-2008-9-9-r137Crossref PubMed Scopus (6659) Google Scholar), detectamos un pico del sitio de unión a ChREBP a 324 pb aguas arriba del promotor Tug1 (Fig. 2D). Para validar mecánicamente la unión de ChREBP al promotor de Tug1 en condiciones de HG, utilizamos un ensayo ChIP mediante la incubación de extractos nucleares de podocitos cultivados cultivados en HG con un anticuerpo de conejo contra ChREBP. Como se muestra en la Fig. 2E, solo ChREBP-IgG, pero no la IgG de conejo de control, enriqueció el ADN de cromatina del promotor Tug1, que se detectó mediante amplificación por PCR, lo que sugiere que ChREBP de hecho se une al promotor Tug1 en condiciones de HG. Para validar aún más la unión de ChREBP al promotor Tug1 en células vivas e identificar los factores reguladores que potencialmente podrían formar un complejo con ChREBP para controlar la expresión de Tug1 en condiciones de HG, utilizamos una combinación de direccionamiento CRISPR y etiquetado de proximidad con una tecnología de ascorbato peroxidasa (APEX2) diseñada (24Myers S.A. Wright J. Peckner R. Kalish B.T. Zhang F. Carr S.A. Descubrimiento de proteínas asociadas con un locus genómico predefinido a través del etiquetado de proximidad mediado por dCas9-APEX.Nat. Methods. 2018; 15 (29735997): 437-43910.1038/s41592-018-0007-1Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 25Lam S.S. Martell J.D. Kamer K.J. Deerinck T.J. Ellisman M.H. Mootha V.K. Ting A.Y. Dirigió la evolución de APEX2 para microscopía electrónica y etiquetado de proximidad.Nat. Methods. 2015; 12 (25419960): 51-5410.1038/nmeth.3179Crossref PubMed Scopus (452) Google Scholar, 26Rhee H.W. Zou P. Udeshi N.D. Martell J.D. Mootha V.K. Carr S.A. Ting A.Y. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spaceally restricted enzymematic tagging.Science. 2013; 339 (23371551): 1328-133110.1126/science.1230593Crossref PubMed Scopus (571) Google Scholar). Diseñamos un vector piggyBac para expresar ARN guía impulsado por el promotor de ARN U6 (ARNg) que se dirige a la región promotora Tug1 y una construcción de fusión Cas9 (dCas9) -APEX2 muerta bajo un potenciador/promotor de CMV (27Kaewsapsak P. Shechner D.M. Mallard W. Rinn J.L. Ting A.Y. Mapeo de células vivas de ARN asociados a orgánulos mediante biotinilación de proximidad combinada con reticulación de proteína-ARN.Elife. 2017; 6: e2922410.7554/eLife.29224Crossref PubMed Scopus (68) Google Scholar) (ver Fig. S2 para el diseño y la secuencia del constructo). Transfectamos esta construcción junto con la transposasa piggyBac (28Galvan D.L. Kettlun C.S. Wilson M.H. Targeting piggyBac transposon integrations in the human genome.in: Storici F. Gene Correction: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ2014: 143-161Crossref Scopus (3) Google Scholar, 29Kahlig K.M. Saridey S.K. Kaja A. Daniels M.A. George Jr., A.L. Wilson M.H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2010; 107 (20080581): 1343-134810.1073/pnas.0910383107Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar) en los podocitos cultivados. Como se muestra en la Fig. 2F, el ARNg dirige la proteína de fusión dCas9-APEX2 a la región promotora de Tug1. En presencia de H2O2, APEX2 oxidará la biotina-fenol en radicales biotina-fenoxilo (27Kaewsapsak P. Shechner D.M. Mallard W. Rinn J.L. Ting A.Y. Live-cell mapping of organelle-associated RNAs via proximity biotinylation combined with protein-RNA crosslinking.Elife. 2017; 6: e2922410.7554/eLife.29224Crossref PubMed Scopus (68) Google Scholar, 30Han S. Udeshi N.D. Deerinck T.J. Svinkina T. Ellisman M.H. Carr S.A. Ting A.Y. Proximity biotinylation as a method for mapping proteins associated with mtDNA in living cells.Cell Chem. Biol. 2017; 24 (28238724): 404-41410.1016/j.chembiol.2017.02.002Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (52) Google Scholar). Los radicales biotina-fenoxilo pueden etiquetar y unirse a proteínas cercanas (radio de ~20 nm) (31Martell J.D. Deerinck T.J. Sancak Y. Poulos T.L. Mootha V.K. Sosinsky G.E. Ellisman M.H. Ting A.Y. Ascorbato peroxidasa modificada genéticamente como un indicador codificado genéticamente para microscopía electrónica.Nat. Biotechnol. 2012; 30 (23086203): 1143-114810.1038/nbt.2375Crossref PubMed Scopus (373) Google Scholar). Utilizamos perlas magnéticas de estreptavidina conjugada para enriquecer las proteínas biotiniladas en podocitos cultivados. Como control, utilizamos podocitos que expresaban dCas9-APEX2 con un ARNg no dirigido. Se procedió a evaluar las proteínas biotiniladas marcadas por dCas9-APEX2 en la región promotora de Tug1 dirigida a ARNg. La inmunotransferencia contra ChREBP mostró que ChREBP estaba biotinilada solo en las células transducidas por el ARNg dirigido al promotor Tug1, pero no en los podocitos de control (Fig. 2G). Es importante destacar que también confirmamos que ChREBP está presente en el promotor Tug1 y HG aumenta su prevalencia (Fig. 2G). Debido a que la ChREBP de ratón tiene dos variantes de transcripción diferentes (61Herman M.A. Peroni O.D. Villoria J. Schon M.R. Abumrad N.A. Bluher M. Klein S. Kahn B.B. Una nueva isoforma de ChREBP en el tejido adiposo regula el metabolismo sistémico de la glucosa. Nature. 2012; 484 (22466288): 333-33810.1038/nature10986Crossref PubMed Scopus (361) Google Scholar), ChREBP-α y ChREBP-β (Fig. 3A), a continuación examinamos qué isoforma responde a HG en la línea celular de podocitos. Usando RT-PCR cuantitativa y cebadores específicos de isoforma, encontramos que solo el transcrito de ChREBP-α está regulado positivamente en condiciones de HG (Fig. 3B). Para explorar la función de ChREBP en la transcripción de Tug1 in vitro, generamos una construcción de expresión de luciferasa impulsada por el promotor Tug1 de 1 kb y la cotransfectamos con una construcción que expresa WT ChREBP-α. En el ensayo indicador de luciferasa, las células cultivadas transfectadas con un vector de control pGL4 tuvieron lecturas de luciferasa insignificantes (Fig. 3C), pero el vector que contenía el promotor Tug1 de 1 kb proporcionó una actividad de luciferasa significativa. Esta actividad promotora se suprimió mediante cotransfección con la construcción de ADNc de ChREBP-α de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3C), lo que sugiere que ChREBP puede reprimir la transcripción de Tug1. Usando ensayos de indicador de luciferasa en podocitos, también comparamos el efecto de dos isoformas de ChREBP en la transcripción de Tug1 y encontramos que ChREBP-β es mucho menos potente para reprimir la transcripción de Tug1 que ChREBP-α (Fig. S3A). Además, encontramos que el factor de transcripción p53 activa significativamente, mientras que YY1 reprime, la transcripción de Tug1 (Fig. S3B), consistente con la presencia de sitios de unión de consenso para estos factores de transcripción en la región promotora (Fig. 2B) e informes anteriores sobre la inducción de la expresión de Tug1 por p53 (32Guttman M. Amit I. Garber M. French C. Lin M.F. Feldser D. Huarte M. Zuk O. Carey B.W. Cassady J.P. Cabili M.N. Jaenisch R. Mikkelsen T.S. Jacks T. Hacohen N. et al. La firma de cromatina revela más de mil ARN no codificantes grandes altamente conservados en mamíferos. Naturaleza. 2009; 458 (19182780): 223-22710.1038/nature07672Crossref PubMed Scopus (2941) Google Scholar, 33Khalil A.M. Guttman M. Huarte M. Garber M. Raj A. Rivea Morales D. Thomas K. Presser A. Bernstein B.E. van Oudenaarden A. Regev A. Lander E.S. Rinn J.L. Muchos ARN no codificantes intergénicos grandes humanos se asocian con complejos modificadores de cromatina y afectan la expresión génica. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009; 106 (19571010): 11667-1167210.1073/pnas.0904715106Crossref PubMed Scopus (2172) Google Scholar). Debido a que hay dos ChoRE potenciales presentes en la región promotora del gen Tug1 murino, también generamos varias construcciones mutantes de ChoRE donde el espaciador de 5 nucleótidos (nt) entre los dos motivos de repetición directa (DR1) se acortó a 4 nt que deberían abolir la unión de ChREBP a ChoRE1 o ChoRE2 (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. Un factor de transcripción sensible a la glucosa que regula el metabolismo de los carbohidratos en el hígado.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001; 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 34Shih H.M. Liu Z. Towle H.C. Dos motivos CACGTG con espaciado adecuado dictan la regulación de carbohidratos de la transcripción génica hepática.J. Biol. Chem. 1995; 270 (7665621): 21991-2199710.1074/jbc.270.37.21991Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar). El mutante ChoRE1 (mut1) no mostró supresión de la actividad del promotor Tug1 (Fig. 3D). El mutante doble (mut3) en el que se produjo la deleción de un solo nucleótido tanto en ChoRE1 como en ChoRE2 mostró una actividad promotora similar a la del mutante ChoRE1. Por el contrario, el mutante ChoRE2 (mut2) mostró el mismo nivel de actividad promotora que el WT (Fig. 3D). Estos resultados indican que ChoRE1, pero no ChoRE2, juega un papel importante en la represión mediada por ChREBP de la expresión de Tug1. Además, utilizamos enfoques de pérdida de función y ganancia de función para examinar el papel de ChREBP en la regulación transcripcional del gen Tug1. Primero derribamos la expresión de ChREBP por ARNhc en podocitos (Fig. 3E). De acuerdo con lo que hemos observado anteriormente, descubrimos que la inactivación de ChREBP condujo a una mayor expresión de Tug1 y su gen diana posterior, Pgc1α. La eficiencia de derribo se mostró mediante transferencia Western (Fig. 3E). Por el contrario, la sobreexpresión de ChREBP condujo a la represión de los genes Tug1 y Pgc1α (Fig. 3F). Estos resultados sugieren que lncRNA Tug1 es un gen diana del factor de transcripción ChREBP. Se sabe que ChREBP se une al ChoRE con otro factor de transcripción, MLX, un socio obligado de ChREBP, formando un heterodímero (14Ma L. Tsatsos N.G. Towle H.C. Papel directo de ChREBP·Mlx en la regulación de genes hepáticos sensibles a la glucosa. J. Biol. Chem. 2005; 280 (15664996): 12019-1202710.1074/jbc.M413063200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 15Stoeckman A.K. Ma L. Towle H.C. Mlx is t
Long noncoding RNAs (lncRNAs) have been shown to play key roles in a variety of biological activities of the cell. However, less is known about how lncRNAs respond to environmental cues and what transcriptional mechanisms regulate their expression. Studies from our laboratory have shown that the lncRNA Tug1 (taurine upregulated gene 1) is crucial for the progression of diabetic kidney disease, a major microvascular complication of diabetes. Using a combination of proximity labeling with the engineered soybean ascorbate peroxidase (APEX2), ChIP-qPCR, biotin-labeled oligonucleotide pulldown, and classical promoter luciferase assays in kidney podocytes, we extend our initial observations in the current study and now provide a detailed analysis on a how high-glucose milieu downregulates Tug1 expression in podocytes. Our results revealed an essential role for the transcription factor carbohydrate response element binding protein (ChREBP) in controlling Tug1 transcription in the podocytes in response to increased glucose levels. Along with ChREBP, other coregulators, including MAX dimerization protein (MLX), MAX dimerization protein 1 (MXD1), and histone deacetylase 1 (HDAC1), were enriched at the Tug1 promoter under high-glucose conditions. These observations provide the first characterization of the mouse Tug1 promoter's response to the high-glucose milieu. Our findings illustrate a molecular mechanism by which ChREBP can coordinate glucose homeostasis with the expression of the lncRNA Tug1 and further our understanding of dynamic transcriptional regulation of lncRNAs in a disease state. Long noncoding RNAs (lncRNAs) have been shown to play key roles in a variety of biological activities of the cell. However, less is known about how lncRNAs respond to environmental cues and what transcriptional mechanisms regulate their expression. Studies from our laboratory have shown that the lncRNA Tug1 (taurine upregulated gene 1) is crucial for the progression of diabetic kidney disease, a major microvascular complication of diabetes. Using a combination of proximity labeling with the engineered soybean ascorbate peroxidase (APEX2), ChIP-qPCR, biotin-labeled oligonucleotide pulldown, and classical promoter luciferase assays in kidney podocytes, we extend our initial observations in the current study and now provide a detailed analysis on a how high-glucose milieu downregulates Tug1 expression in podocytes. Our results revealed an essential role for the transcription factor carbohydrate response element binding protein (ChREBP) in controlling Tug1 transcription in the podocytes in response to increased glucose levels. Along with ChREBP, other coregulators, including MAX dimerization protein (MLX), MAX dimerization protein 1 (MXD1), and histone deacetylase 1 (HDAC1), were enriched at the Tug1 promoter under high-glucose conditions. These observations provide the first characterization of the mouse Tug1 promoter's response to the high-glucose milieu. Our findings illustrate a molecular mechanism by which ChREBP can coordinate glucose homeostasis with the expression of the lncRNA Tug1 and further our understanding of dynamic transcriptional regulation of lncRNAs in a disease state. Long noncoding RNAs (lncRNAs) are classically known as diverse RNA transcripts that are more than 200 nucleotides long and are not translated into proteins or encode very short peptides (1Ransohoff J.D. Wei Y. Khavari P.A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018; 19 (29138516): 143-15710.1038/nrm.2017.104Crossref PubMed Scopus (367) Google Scholar, 2Ulitsky I. Bartel D.P. lincRNAs: genomics, evolution, and mechanisms.Cell. 2013; 154 (23827673): 26-4610.1016/j.cell.2013.06.020Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1593) Google Scholar). Recent advances in high-throughput DNA sequencing and single-cell RNA-Seq studies have revealed that lncRNAs have crucial roles in regulating gene expression and play broad roles impacting human physiology and pathophysiology (1Ransohoff J.D. Wei Y. Khavari P.A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018; 19 (29138516): 143-15710.1038/nrm.2017.104Crossref PubMed Scopus (367) Google Scholar, 3Kopp F. Mendell J.T. Functional classification and experimental dissection of long noncoding RNAs.Cell. 2018; 172 (29373828): 393-40710.1016/j.cell.2018.01.011Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1097) Google Scholar), yet despite the striking prevalence of lncRNAs and countless attempts to explore their function, the functional landscape of the majority of lncRNAs remains elusive (3Kopp F. Mendell J.T. Functional classification and experimental dissection of long noncoding RNAs.Cell. 2018; 172 (29373828): 393-40710.1016/j.cell.2018.01.011Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1097) Google Scholar, 4Zhao Y. Li H. Fang S. Kang Y. Wu W. Hao Y. Li Z. Bu D. Sun N. Zhang M.Q. Chen R. NONCODE 2016: an informative and valuable data source of long non-coding RNAs.Nucleic Acids Res. 2016; 44 (26586799): D203-D20810.1093/nar/gkv1252Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar, 5St Laurent G. Wahlestedt C. Kapranov P. The landscape of long noncoding RNA classification.Trends Genet. 2015; 31 (25869999): 239-25110.1016/j.tig.2015.03.007Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (556) Google Scholar). Growing evidence suggests that lncRNAs play key roles in linking the metabolic state of the cell to extracellular cues and nutrient availability. For instance, we have recently shown that the lncRNA Tug1 is downregulated in the podocytes of diabetic mice and plays an important role in progression of diabetic nephropathy (6Long J. Badal S.S. Ye Z. Wang Y. Ayanga B.A. Galvan D.L. Green N.H. Chang B.H. Overbeek P.A. Danesh F.R. Long noncoding RNA Tug1 regulates mitochondrial bioenergetics in diabetic nephropathy.J. Clin. Investig. 2016; 126 (27760051): 4205-421810.1172/JCI87927Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar). Mechanistically, we found that Tug1 regulates the expression of PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α), a master transcription regulator of mitochondrial biogenesis, under high-glucose (HG) stress conditions by binding to an enhancer region that is 400 kb upstream of the PGC-1α gene, serving as a bridge that connects the cis-element and trans-factor for the expression of this important mitochondrial master regulator. However, despite much progress in identifying the biological scope and the function of Tug1, our current understanding of the precise regulation of Tug1 and its upstream transcriptional regulatory mechanisms remains very limited. lncRNAs are often expressed in tissue- and/or development-specific patterns (7Washietl S. Kellis M. Garber M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals.Genome Res. 2014; 24 (24429298): 616-62810.1101/gr.165035.113Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 8Mattioli K. Volders P.J. Gerhardinger C. Lee J.C. Maass P.G. Mele M. Rinn J.L. High-throughput functional analysis of lncRNA core promoters elucidates rules governing tissue specificity.Genome Res. 2019; 29 (30683753): 344-35510.1101/gr.242222.118Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar), suggesting that their expression is tightly regulated by a number of well-characterized transcription factors (7Washietl S. Kellis M. Garber M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals.Genome Res. 2014; 24 (24429298): 616-62810.1101/gr.165035.113Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 8Mattioli K. Volders P.J. Gerhardinger C. Lee J.C. Maass P.G. Mele M. Rinn J.L. High-throughput functional analysis of lncRNA core promoters elucidates rules governing tissue specificity.Genome Res. 2019; 29 (30683753): 344-35510.1101/gr.242222.118Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar, 9Mele M. Mattioli K. Mallard W. Shechner D.M. Gerhardinger C. Rinn J.L. Chromatin environment, transcriptional regulation, and splicing distinguish lincRNAs and mRNAs.Genome Res. 2017; 27 (27927715): 27-3710.1101/gr.214205.116Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar). In this study, we provide strong evidence indicating that the HG-mediated suppression of Tug1 expression is, at least in part, regulated by ChREBP (carbohydrate response element binding protein, also known as MLXIPL, for Mlx-interacting protein-like), a major glucose-responsive transcription factor (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. A glucose-responsive transcription factor that regulates carbohydrate metabolism in the liver.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001; 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). Enriched in adipose tissue, ChREBP is a basic helix-loop-helix leucine zipper transcription factor that regulates glucose homeostasis and the response to dietary carbohydrates (11Abdul-Wahed A. Guilmeau S. Postic C. Sweet sixteenth for ChREBP: established roles and future goals.Cell Metab. 2017; 26 (28768172): 324-34110.1016/j.cmet.2017.07.004Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar, 12Baraille F. Planchais J. Dentin R. Guilmeau S. Postic C. Integration of ChREBP-mediated glucose sensing into whole body metabolism.Physiology. 2015; 30 (26525342): 428-43710.1152/physiol.00016.2015Crossref PubMed Scopus (32) Google Scholar, 13Iizuka K. The transcription factor carbohydrate-response element-binding protein (ChREBP): A possible link between metabolic disease and cancer.Biochim. Biophys. Acta. 2017; 1863 (27919710): 474-48510.1016/j.bbadis.2016.11.029Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar). Indeed, an HG environment promotes ChREBP translocation to the nucleus, leading to the formation of a heterodimeric complex with MLX (Max-like protein X) and binding to the carbohydrate response elements (ChoRE) of ChREBP target genes in the nucleus (14Ma L. Tsatsos N.G. Towle H.C. Direct role of ChREBP·Mlx in regulating hepatic glucose-responsive genes.J. Biol. Chem. 2005; 280 (15664996): 12019-1202710.1074/jbc.M413063200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 15Stoeckman A.K. Ma L. Towle H.C. Mlx is the functional heteromeric partner of the carbohydrate response element-binding protein in glucose regulation of lipogenic enzyme genes.J. Biol. Chem. 2004; 279 (14742444): 15662-1566910.1074/jbc.M311301200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (154) Google Scholar, 16Merla G. Howald C. Antonarakis S.E. Reymond A. The subcellular localization of the ChoRE-binding protein, encoded by the Williams–Beuren syndrome critical region gene 14, is regulated by 14-3-3.Hum. Mol. Genet. 2004; 13 (15163635): 1505-151410.1093/hmg/ddh163Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar). In the current study, we show that in response to HG milieu, ChREBP can recruit other members of the ChREBP network, including MLX, MAX (Myc-associated factor), MXD1 (Max dimerization protein 1), and HDAC1 (histone deacetylase 1), to a ChoRE element and neighboring E-box (enhancer box) in the Tug1 promoter, suppressing transcriptional activity. The human lncRNA TUG1 gene (NCBI reference sequence NR_110492 transcript variant 1) is located on chromosome 22q12.2 and has 8 variant transcripts, ranging from 5.2–7.6 kilobase in length, whereas the murine Tug1 lncRNA locus is located on chromosome 11 and has three variant (a, b, and c) transcripts that are 4.1–6.7 kilobases long (Fig. 1A). The Tug1 promoter has in vitro transcriptional activity in both orientations and acts as a bidirectional promoter driving the expression of the protein-coding gene Morc2a as well (4Zhao Y. Li H. Fang S. Kang Y. Wu W. Hao Y. Li Z. Bu D. Sun N. Zhang M.Q. Chen R. NONCODE 2016: an informative and valuable data source of long non-coding RNAs.Nucleic Acids Res. 2016; 44 (26586799): D203-D20810.1093/nar/gkv1252Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar, 17Derrien T. Johnson R. Bussotti G. Tanzer A. Djebali S. Tilgner H. Guernec G. Martin D. Merkel A. Knowles D.G. Lagarde J. Veeravalli L. Ruan X. Ruan Y. Lassmann T. et al.The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.Genome Res. 2012; 22 (22955988): 1775-178910.1101/gr.132159.111Crossref PubMed Scopus (3082) Google Scholar, 18Sigova A.A. Mullen A.C. Molinie B. Gupta S. Orlando D.A. Guenther M.G. Almada A.E. Lin C. Sharp P.A. Giallourakis C.C. Young R.A. Divergent transcription of long noncoding RNA/mRNA gene pairs in embryonic stem cells.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2013; 110 (23382218): 2876-288110.1073/pnas.1221904110Crossref PubMed Scopus (307) Google Scholar). Consistent with a classical feature of bidirectional promoters, where the transcription start sites (TSS) of the two genes are predictably separated by less than 1 kb, the Morc2a TSS is separated by only 374 bp from the Tug1 TSS. Importantly, Tug1 is highly conserved among species and shows a wide tissue expression pattern in mice, rats, and humans (Fig. 1B) (4Zhao Y. Li H. Fang S. Kang Y. Wu W. Hao Y. Li Z. Bu D. Sun N. Zhang M.Q. Chen R. NONCODE 2016: an informative and valuable data source of long non-coding RNAs.Nucleic Acids Res. 2016; 44 (26586799): D203-D20810.1093/nar/gkv1252Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar, 19Fagerberg L. Hallström B.M. Oksvold P. Kampf C. Djureinovic D. Odeberg J. Habuka M. Tahmasebpoor S. Danielsson A. Edlund K. Asplund A. Sjöstedt E. Lundberg E. Szigyarto C.A.-K. Skogs M. et al.Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.Mol. Cell. Proteomics. 2014; 13 (24309898): 397-40610.1074/mcp.M113.035600Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1405) Google Scholar). Moreover, the Tug1 locus is enriched with key features of active transcription, such as open chromatin regions harboring transcription factors and histone modifications, including H3 lysine 4-trimethylation (H3K4me3) and H3K36me3 (Fig. 1A), suggesting active transcription along the Tug1 gene body. Previously, we had identified Tug1 as an lncRNA that is downregulated in the diabetic milieu using an unbiased RNA-sequencing (RNA-Seq) analysis of kidney glomeruli (6Long J. Badal S.S. Ye Z. Wang Y. Ayanga B.A. Galvan D.L. Green N.H. Chang B.H. Overbeek P.A. Danesh F.R. Long noncoding RNA Tug1 regulates mitochondrial bioenergetics in diabetic nephropathy.J. Clin. Investig. 2016; 126 (27760051): 4205-421810.1172/JCI87927Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar). Here, we have expanded on our previous observations, finding significantly reduced expression of Tug1 in several kidney cell lines that were cultured under HG conditions, including podocytes (Fig. 1C), TCMK-1 tubular cells (Fig. 1D), and HeLa cells (Fig. 1E). Notably, all three isoforms of Tug1 transcripts were downregulated under HG condition in podocyte (Fig. S1). We also validated that podocytes isolated from kidneys of leptin receptor-deficient (db/db) mice, an established model of type 2 diabetes, exhibited significant downregulation of Tug1 expression compared with podocytes obtained from control nondiabetic (db/m) mice (Fig. 1F). We next argued that the Tug1 downregulation could be because of diminished transcriptional activity or enhanced RNA degradation under high-glucose conditions. Therefore, we monitored Tug1 RNA abundance by quantitative RT-PCR in the presence of actinomycin D, which intercalates into DNA, forming a stable complex and thereby inhibiting new RNA transcription (Fig. 1G). We found that the rate of RNA degradation was not significantly different between cells cultured under HG or NG conditions. This result suggests that the rate of Tug1 degradation was similar in podocytes whether cultured under HG or NG conditions and indicates that HG-mediated downregulation of Tug1 was mainly because of its transcriptional regulation. Because previous results had suggested that the Tug1 promoter acts as a bidirectional promoter driving the expression of Morc2a, we also determined whether HG has the same effect on Morc2a expression. To this end, cultured podocytes were exposed to HG for 24 h or 48 h (Fig. 1H). Unlike its neighbor Tug1 gene, which is transcribed in an opposite strand, we found that HG only modestly inhibited the expression of Morc2a at 48 h but not at 24 h. On the other hand, HG treatment did not have a significant effect on MORC2 mRNA expression in HeLa cells (Fig. 1I). These results suggest that HG does not have a consistent effect on Morc2a expression. To further explore how HG regulates Tug1 transcription, we retrieved the promoter region of the murine Tug1 gene to identify potential binding sites for transcription factors. Alignment of mouse, human, and rat Tug1 promoter sequences indicated that these sequences are highly conserved, with over 90% of the sequences identical among these three species (Figs. 2A–C). Using a web-based tool, rVista 2.0, we identified several potential binding sites for transcription factors (Fig. 2B). Notably, we found multiple p53 candidate binding sites as well as SP1, YY1, E47, IRF-3, and PPAR-α binding sites. Importantly, we also found one ChoRE consensus sequence in this region that was almost identical in the three species we analyzed (Fig. 2B and C). The ChoRE sequence matched well with the consensus motif where two E-boxes (CAYGYG and CRCRTG) are separated by 5 nucleotides (where Y denotes pyrimidine [C or T] and R denotes purine [A or G]) (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. A glucose-responsive transcription factor that regulates carbohydrate metabolism in the liver.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001; 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 20Jeong Y.S. Kim D. Lee Y.S. Kim H.J. Han J.Y. Im S.S. Chong H.K. Kwon J.K. Cho Y.H. Kim W.K. Osborne T.F. Horton J.D. Jun H.S. Ahn Y.H. Ahn S.M. et al.Integrated expression profiling and genome-wide analysis of ChREBP targets reveals the dual role for ChREBP in glucose-regulated gene expression.PLoS ONE. 2011; 6 (21811631): e2254410.1371/journal.pone.0022544Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar, 21Poungvarin N. Chang B. Imamura M. Chen J. Moolsuwan K. Sae-Lee C. Li W. Chan L. Genome-wide analysis of ChREBP binding sites on male mouse liver and white adipose chromatin.Endocrinology. 2015; 156 (25751637): 1982-199410.1210/en.2014-1666Crossref PubMed Scopus (47) Google Scholar, 22Ma L. Robinson L.N. Towle H.C. ChREBP·Mlx is the principal mediator of glucose-induced gene expression in the liver.J. Biol. Chem. 2006; 281 (16885160): 28721-2873010.1074/jbc.M601576200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (281) Google Scholar). Identifying ChoRE as a potential signature motif in the region was of great interest to us, because previous reports had demonstrated that ChoRE is recognized by the transcriptional factor ChREBP, a key transcription factor that is upregulated under HG conditions (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. A glucose-responsive transcription factor that regulates carbohydrate metabolism in the liver.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001; 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 11Abdul-Wahed A. Guilmeau S. Postic C. Sweet sixteenth for ChREBP: established roles and future goals.Cell Metab. 2017; 26 (28768172): 324-34110.1016/j.cmet.2017.07.004Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar). We then screened whether the Tug1 promoter serves as a ChREBP binding site by taking advantage of genome-wide ChIP-Seq (ChIP coupled with high-throughput DNA sequencing) data from one of our previous studies of adipose tissue (21Poungvarin N. Chang B. Imamura M. Chen J. Moolsuwan K. Sae-Lee C. Li W. Chan L. Genome-wide analysis of ChREBP binding sites on male mouse liver and white adipose chromatin.Endocrinology. 2015; 156 (25751637): 1982-199410.1210/en.2014-1666Crossref PubMed Scopus (47) Google Scholar). Using model-based analysis of ChIP-Seq (MACS) (23Zhang Y. Liu T. Meyer C.A. Eeckhoute J. Johnson D.S. Bernstein B.E. Nusbaum C. Myers R.M. Brown M. Li W. Liu X.S. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).Genome Biol. 2008; 9 (18798982): R13710.1186/gb-2008-9-9-r137Crossref PubMed Scopus (6659) Google Scholar), we detected a peak of ChREBP binding site at 324 bp upstream of the Tug1 promoter (Fig. 2D). To mechanistically validate binding of ChREBP to the promoter of Tug1 under HG conditions, we used a ChIP assay by incubating nuclear extracts of cultured podocytes grown under HG with a rabbit antibody against ChREBP. As shown in Fig. 2E, only ChREBP-IgG, but not the control rabbit IgG, enriched Tug1 promoter chromatin DNA, which was detected by PCR amplification, suggesting that ChREBP indeed binds to the Tug1 promoter under HG conditions. To further validate binding of ChREBP to the Tug1 promoter in live cells and to identify the regulatory factors that could potentially form a complex with ChREBP to control Tug1 expression under HG conditions, we used a combination of CRISPR targeting and proximity labeling with an engineered ascorbate peroxidase (APEX2) technology (24Myers S.A. Wright J. Peckner R. Kalish B.T. Zhang F. Carr S.A. Discovery of proteins associated with a predefined genomic locus via dCas9–APEX-mediated proximity labeling.Nat. Methods. 2018; 15 (29735997): 437-43910.1038/s41592-018-0007-1Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 25Lam S.S. Martell J.D. Kamer K.J. Deerinck T.J. Ellisman M.H. Mootha V.K. Ting A.Y. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.Nat. Methods. 2015; 12 (25419960): 51-5410.1038/nmeth.3179Crossref PubMed Scopus (452) Google Scholar, 26Rhee H.W. Zou P. Udeshi N.D. Martell J.D. Mootha V.K. Carr S.A. Ting A.Y. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.Science. 2013; 339 (23371551): 1328-133110.1126/science.1230593Crossref PubMed Scopus (571) Google Scholar). We engineered a piggyBac vector to express U6 RNA promoter-driven guide RNA (gRNA) that targets the Tug1 promoter region and a dead Cas9 (dCas9)-APEX2 fusion construct under a CMV enhancer/promoter (27Kaewsapsak P. Shechner D.M. Mallard W. Rinn J.L. Ting A.Y. Live-cell mapping of organelle-associated RNAs via proximity biotinylation combined with protein-RNA crosslinking.Elife. 2017; 6: e2922410.7554/eLife.29224Crossref PubMed Scopus (68) Google Scholar) (see Fig. S2 for construct design and sequence). We transfected this construct together with piggyBac transposase (28Galvan D.L. Kettlun C.S. Wilson M.H. Targeting piggyBac transposon integrations in the human genome.in: Storici F. Gene Correction: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ2014: 143-161Crossref Scopus (3) Google Scholar, 29Kahlig K.M. Saridey S.K. Kaja A. Daniels M.A. George Jr., A.L. Wilson M.H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2010; 107 (20080581): 1343-134810.1073/pnas.0910383107Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar) into the cultured podocytes. As depicted in Fig. 2F, the gRNA directs the fusion protein dCas9-APEX2 to the Tug1 promoter region. In the presence of H2O2, APEX2 will oxidize biotin-phenol into biotin-phenoxyl radicals (27Kaewsapsak P. Shechner D.M. Mallard W. Rinn J.L. Ting A.Y. Live-cell mapping of organelle-associated RNAs via proximity biotinylation combined with protein-RNA crosslinking.Elife. 2017; 6: e2922410.7554/eLife.29224Crossref PubMed Scopus (68) Google Scholar, 30Han S. Udeshi N.D. Deerinck T.J. Svinkina T. Ellisman M.H. Carr S.A. Ting A.Y. Proximity biotinylation as a method for mapping proteins associated with mtDNA in living cells.Cell Chem. Biol. 2017; 24 (28238724): 404-41410.1016/j.chembiol.2017.02.002Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (52) Google Scholar). The biotin-phenoxyl radicals can tag and attach to nearby proteins (∼20-nm radius) (31Martell J.D. Deerinck T.J. Sancak Y. Poulos T.L. Mootha V.K. Sosinsky G.E. Ellisman M.H. Ting A.Y. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy.Nat. Biotechnol. 2012; 30 (23086203): 1143-114810.1038/nbt.2375Crossref PubMed Scopus (373) Google Scholar). We used magnetic conjugated streptavidin beads to enrich the biotinylated proteins in cultured podocytes. As a control, we used podocytes that expressed dCas9-APEX2 with a nontargeting gRNA. We proceeded to assess the biotinylated proteins labeled by dCas9-APEX2 in the gRNA-targeted Tug1 promoter region. Immunoblotting against ChREBP showed that ChREBP was biotinylated only in the cells transduced by the Tug1 promoter-targeted gRNA but not in the control podocytes (Fig. 2G). Importantly, we also confirmed that ChREBP is present at the Tug1 promoter and HG increases its prevalence (Fig. 2G). Because mouse ChREBP has two different transcript variants (61Herman M.A. Peroni O.D. Villoria J. Schon M.R. Abumrad N.A. Bluher M. Klein S. Kahn B.B. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic glucose metabolism.Nature. 2012; 484 (22466288): 333-33810.1038/nature10986Crossref PubMed Scopus (361) Google Scholar), ChREBP-α and ChREBP-β (Fig. 3A), we next examined which isoform is HG responsive in the podocyte cell line. Using quantitative RT-PCR and isoform-specific primers, we found that only the ChREBP-α transcript is upregulated under HG conditions (Fig. 3B). To explore the function of ChREBP on Tug1 transcription in vitro, we generated a luciferase expression construct driven by the 1-kb Tug1 promoter and cotransfected it with a construct expressing WT ChREBP-α. In the luciferase reporter assay, cultured cells transfected with a pGL4 control vector had negligible luciferase readings (Fig. 3C), but the vector containing the 1-kb Tug1 promoter gave significant luciferase activity. This promoter activity was suppressed by cotransfection with the ChREBP-α cDNA construct in a dose-dependent manner (Fig. 3C), suggesting that ChREBP can repress Tug1 transcription. Using luciferase reporter assays in podocytes, we also compared the effect of two ChREBP isoforms on Tug1 transcription and found that ChREBP-β is much less potent for repressing Tug1 transcription than ChREBP-α (Fig. S3A). Furthermore, we found transcription factor p53 significantly activates, whereas YY1 represses, Tug1 transcription (Fig. S3B), consistent with the presence of consensus binding sites for these transcription factors in the promoter region (Fig. 2B) and previous reports about the induction of Tug1 expression by p53 (32Guttman M. Amit I. Garber M. French C. Lin M.F. Feldser D. Huarte M. Zuk O. Carey B.W. Cassady J.P. Cabili M.N. Jaenisch R. Mikkelsen T.S. Jacks T. Hacohen N. et al.Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals.Nature. 2009; 458 (19182780): 223-22710.1038/nature07672Crossref PubMed Scopus (2941) Google Scholar, 33Khalil A.M. Guttman M. Huarte M. Garber M. Raj A. Rivea Morales D. Thomas K. Presser A. Bernstein B.E. van Oudenaarden A. Regev A. Lander E.S. Rinn J.L. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009; 106 (19571010): 11667-1167210.1073/pnas.0904715106Crossref PubMed Scopus (2172) Google Scholar). Because there are two potential ChoREs present in the promoter region of the murine Tug1 gene, we also generated several ChoRE mutant constructs where the 5-nucleotide (nt) spacer between the two direct repeat (DR1) motifs was shortened to 4 nt that should abolish the binding of ChREBP to either ChoRE1 or ChoRE2 (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. A glucose-responsive transcription factor that regulates carbohydrate metabolism in the liver.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001; 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 34Shih H.M. Liu Z. Towle H.C. Two CACGTG motifs with proper spacing dictate the carbohydrate regulation of hepatic gene transcription.J. Biol. Chem. 1995; 270 (7665621): 21991-2199710.1074/jbc.270.37.21991Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar). The mutant ChoRE1 (mut1) failed to show suppression of the Tug1 promoter activity (Fig. 3D). The double mutant (mut3) in which single-nucleotide deletion occurred in both ChoRE1 and ChoRE2 showed promoter activity similar to that of the ChoRE1 mutant. In contrast, mutant ChoRE2 (mut2) showed the same level of promoter activity as the WT (Fig. 3D). These results indicate that ChoRE1, but not ChoRE2, plays an important role in ChREBP-mediated repression of Tug1 expression. We further used loss-of-function and gain-of-function approaches to examine the role of ChREBP in the transcriptional regulation of the Tug1 gene. We first knocked down ChREBP expression by shRNA in podocytes (Fig. 3E). Consistent with our previous observations, we found that ChREBP knockdown led to enhanced expression of Tug1 and its downstream target gene, Pgc1α. The knockdown efficiency was shown by Western blotting (Fig. 3E). Conversely, ChREBP overexpression led to the repression of both Tug1 and Pgc1α genes (Fig. 3F). These results suggest that lncRNA Tug1 is a target gene of transcription factor ChREBP. ChREBP is known to bind to the ChoRE with another transcription factor, MLX, a ChREBP obligate partner, forming a heterodimer (14Ma L. Tsatsos N.G. Towle H.C. Direct role of ChREBP·Mlx in regulating hepatic glucose-responsive genes.J. Biol. Chem. 2005; 280 (15664996): 12019-1202710.1074/jbc.M413063200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 15Stoeckman A.K. Ma L. Towle H.C. Mlx is t
وقد ثبت أن الحمض النووي الريبوزي غير المشفر الطويل (lncRNAs) يلعب أدوارًا رئيسية في مجموعة متنوعة من الأنشطة البيولوجية للخلية. ومع ذلك، لا يُعرف الكثير عن كيفية استجابة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين للإشارات البيئية وما هي آليات النسخ التي تنظم تعبيرها. وقد أظهرت الدراسات من مختبرنا أن lncRNA Tug1 (الجين 1 المنظم للتورين) أمر بالغ الأهمية لتطور مرض الكلى السكري، وهو أحد المضاعفات الوعائية الدقيقة الرئيسية لمرض السكري. باستخدام مزيج من وضع العلامات التقاربية مع بيروكسيديز أسكوربات فول الصويا المهندسة (APEX2)، و ChIP - qPCR، وسحب الأوليجو نوكليوتيد المسمى بالبيوتين، ومقايسات لوسيفيراز المحفز الكلاسيكي في خلايا الأقدام الكلوية، نوسع ملاحظاتنا الأولية في الدراسة الحالية ونقدم الآن تحليلًا مفصلاً حول كيفية قيام الأوساط عالية الجلوكوز بتقليل تنظيم تعبير Tug1 في خلايا الأقدام. كشفت نتائجنا عن دور أساسي لبروتين ربط عنصر استجابة الكربوهيدرات (ChREBP) لعامل النسخ في التحكم في نسخ Tug1 في الخلايا الجذعية استجابة لزيادة مستويات الجلوكوز. جنبا إلى جنب مع ChREBP، تم إثراء منظمات مشتركة أخرى، بما في ذلك بروتين دايميريزاتيون ماكس (MLX)، وبروتين دايميريزاتيون ماكس 1 (MXD1)، و هيستون ديسيتيلز 1 (HDAC1)، في معزز Tug1 في ظل ظروف عالية الجلوكوز. توفر هذه الملاحظات أول توصيف لاستجابة معزز الجر 1 للوسط المرتفع الجلوكوز. توضح النتائج التي توصلنا إليها آلية جزيئية يمكن من خلالها لـ ChREBP تنسيق توازن الجلوكوز مع التعبير عن lncRNA Tug1 وزيادة فهمنا للتنظيم النسخي الديناميكي لـ lncRNAs في حالة المرض. وقد ثبت أن الحمض النووي الريبوزي غير المشفر الطويل (lncRNAs) يلعب أدوارًا رئيسية في مجموعة متنوعة من الأنشطة البيولوجية للخلية. ومع ذلك، لا يُعرف الكثير عن كيفية استجابة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين للإشارات البيئية وما هي آليات النسخ التي تنظم تعبيرها. وقد أظهرت الدراسات من مختبرنا أن lncRNA Tug1 (الجين 1 المنظم للتورين) أمر بالغ الأهمية لتطور مرض الكلى السكري، وهو أحد المضاعفات الوعائية الدقيقة الرئيسية لمرض السكري. باستخدام مزيج من وضع العلامات التقاربية مع بيروكسيديز أسكوربات فول الصويا المهندسة (APEX2)، و ChIP - qPCR، وسحب الأوليجو نوكليوتيد المسمى بالبيوتين، ومقايسات لوسيفيراز المحفز الكلاسيكي في خلايا الأقدام الكلوية، نوسع ملاحظاتنا الأولية في الدراسة الحالية ونقدم الآن تحليلًا مفصلاً حول كيفية قيام الأوساط عالية الجلوكوز بتقليل تنظيم تعبير Tug1 في خلايا الأقدام. كشفت نتائجنا عن دور أساسي لبروتين ربط عنصر استجابة الكربوهيدرات (ChREBP) لعامل النسخ في التحكم في نسخ Tug1 في الخلايا الجذعية استجابة لزيادة مستويات الجلوكوز. جنبا إلى جنب مع ChREBP، تم إثراء منظمات مشتركة أخرى، بما في ذلك بروتين دايميريزاتيون ماكس (MLX)، وبروتين دايميريزاتيون ماكس 1 (MXD1)، و هيستون ديسيتيلز 1 (HDAC1)، في معزز Tug1 في ظل ظروف عالية الجلوكوز. توفر هذه الملاحظات أول توصيف لاستجابة معزز الجر 1 للفأر للوسط المرتفع الجلوكوز. توضح النتائج التي توصلنا إليها آلية جزيئية يمكن من خلالها لـ ChREBP تنسيق توازن الجلوكوز مع التعبير عن lncRNA Tug1 وزيادة فهمنا للتنظيم النسخي الديناميكي لـ lncRNAs في حالة المرض. تُعرف الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNAs) كلاسيكيًا باسم نسخ الحمض النووي الريبي المتنوعة التي يزيد طولها عن 200 نيوكليوتيد ولا يتم ترجمتها إلى بروتينات أو تشفير ببتيدات قصيرة جدًا (1Ransohoff JD Wei Y. Khavari PA الوظائف والسمات الفريدة للحمض النووي الريبي غير المشفر طويل الجينات. Rev. Mol. Cell Biol. 2018; 19 (29138516): 143-15710.1038/nrm.2017.104Crossref PubMed Scopus (367) Google Scholar, 2Ulitsky I. Bartel D.P. lincRNAs: genomics, evolution, and mechanismss.Cell. 2013; 154 (23827673): 26-4610.1016/j.cell.2013.06.020Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1593) Google Scholar). كشفت التطورات الحديثة في تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية ودراسات تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية أن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين له أدوار حاسمة في تنظيم التعبير الجيني ويلعب أدوارًا واسعة تؤثر على علم وظائف الأعضاء البشرية والفيزيولوجيا المرضية (1Ransohoff JD Wei Y. Khavari PA الوظائف والسمات الفريدة للحمض النووي الريبوزي طويل الأمد غير المشفر بين الجينات. Rev. Mol. Cell Biol. 2018; 19 (29138516): 143-15710.1038/nrm.2017.104Crossref PubMed Scopus (367) Google Scholar, 3Kopp F. Mendell J.T. Functional classification and experimental dissection of long noncoding RNAsCell. 2018; 172 (29373828): 393-40710.1016/j.cell.2018.01.011Abstract full text PDF PubMed Scopus (1097) Google Scholar)، ولكن على الرغم من الانتشار المذهل لـ lncRNAs والمحاولات التي لا تعد ولا تحصى لاستكشاف وظيفتها، لا يزال المشهد الوظيفي لغالبية lncRNAs بعيد المنال (3Kopp F. Mendell J.T. Functional classification and experimental dissection of long noncoding RNAsCell. 2018; 172 (29373828): 393-4071016/j.08.011Astract full text PDF Pubed Scopus (1097 Google Scholar, 4.K.H. Yang F. Yu Yu. Yu. Yang Z. Zho. Zh. D. N. Ch. N. N. N. N. N. N. N. N. N. N. N. N. N. N. N. N. N. C. N. D. D. D. D. A. D. D. D. A. D. D. D. A. D. A. D. D. A. D. N. D. D. D. A. D. A. D. D. A. A. D. D. N. D. N. A. D. D. D. A. D. D. N. D. D. D. N. A. N. N. A. D. A. A. N. A. N. N. A. A. A. N. A. N. N. N. D. N. N. A. N. N. N. A. D. A. A. D. D. N. A. D. N. N. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. N. D. D. D. D. N. D. D. D. N. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. D. N. N. N. N. N. N. N. N. N. N. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. D. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. T. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين يلعب أدوارًا رئيسية في ربط الحالة الأيضية للخلية بالإشارات خارج الخلية وتوافر المغذيات. على سبيل المثال، أظهرنا مؤخرًا أن lncRNA Tug1 يتم تقليل تنظيمه في خلايا الفئران المصابة بالسكري ويلعب دورًا مهمًا في تطور اعتلال الكلية السكري (6Long J. Badal S.S. Ye Z. Wang Y. Ayanga B.A. Galvan D.L. Green N.H. Chang B.H. Overbeek PA Danesh F.R. ينظم RNA Tug1 الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في اعتلال الكلية السكري.J. Clin. التحقيق. 2016 ؛ 126 (27760051): 4205-421810.1172/JCI87927Crossref PubMed Scopus (188) الباحث العلمي من Google). ميكانيكياً، وجدنا أن Tug1 ينظم التعبير عن PGC -1 α (المنشط المشترك لمستقبلات جاما المنشط بالبيروكسيزوم 1 α)، وهو منظم نسخ رئيسي للتكوين الحيوي للميتوكوندريا، في ظل ظروف إجهاد عالية الجلوكوز (HG) عن طريق الارتباط بمنطقة محسنة تقع على بعد 400 كيلوبايت من المنبع لجين PGC -1 α، وتعمل كجسر يربط عنصر رابطة الدول المستقلة والعامل العابر للتعبير عن هذا المنظم الرئيسي المهم للميتوكوندريا. ومع ذلك، على الرغم من التقدم الكبير في تحديد النطاق البيولوجي ووظيفة Tug1، فإن فهمنا الحالي للتنظيم الدقيق لـ Tug1 وآلياته التنظيمية النسخية الأولية لا يزال محدودًا للغاية. غالبًا ما يتم التعبير عن lncRNAs في أنماط خاصة بالأنسجة و/أو التطور (7Washietl S. Kellis M. Garber M. الديناميكيات التطورية وخصوصية الأنسجة للحمض النووي الريبي البشري غير المشفر في ستة ثدييات. Genome Res. 2014; 24 (24429298): 616-62810.1101/gr.165035.113Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 8Mattioli K. Volders P.J. Gerhardinger C. Lee JC Maass P.G. Mele M. Rinn J.L. تحليل وظيفي عالي الإنتاجية للمروجين الأساسيين للحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين يوضح القواعد التي تحكم خصوصية الأنسجة. Genome Res. 2019 ؛ 29 (30683753): 344-35510.1101/gr.242222.118 Crossref PubMed Scopus (33) الباحث العلمي من Google)، مما يشير إلى أن تعبيرهم منظم بإحكام من خلال عدد من عوامل النسخ المميزة جيدًا (7Washietl S. Kellis M. Garber M. الديناميكيات التطورية وخصوصية الأنسجة للحمض النووي الريبوزي طويل الأمد غير المشفر في ستة ثدييات. Genome Res. 2014 ؛ 24 (24429298): 616-62810.1101/gr.165035.113 Crossref PubMed Scopus (226) الباحث العلمي من Google، 8Mattioli K. Volders P.J. Gerhardinger C. Lee J.C. Maassle M. Rinn J. تحليل وظيفي عالي الأداء لمروجات المروجات الأساسية لـ RNA يوضح القواعد التي تحكم خصوصية الأنسجة. Genome Res. 2019; 29 (30683753): 344-35510.1101/gr.242222.118Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar, 9Mele M. Mattioli K. Mallard W. Shechner D.M. Gerhardinger C. Rinn J.L. Chromatin environment, transcriptional regulation, and splicing distinct lincRNAs and mRNAs.Genome Res. 2017; 27 (27927715): 27-3710.1101/gr.214205.116Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar). في هذه الدراسة، نقدم أدلة قوية تشير إلى أن قمع تعبير Tug1 بوساطة HG، على الأقل جزئيًا، ينظمه ChREBP (بروتين رابط لعنصر استجابة الكربوهيدرات، والمعروف أيضًا باسم MLXIPL، للبروتين المتفاعل مع Mlx)، وهو عامل نسخ رئيسي يستجيب للجلوكوز (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. عامل نسخ يستجيب للجلوكوز ينظم استقلاب الكربوهيدرات في الكبد. Natl. Acad. Sci. U. S. 2001 ؛ 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). غني بالأنسجة الدهنية، ChREBP هو عامل نسخ سحاب اللولب الحلزوني الأساسي الذي ينظم توازن الجلوكوز والاستجابة للكربوهيدرات الغذائية (11Abdul - Wahed A. Guilmeau S. Postic C. الحلو السادس عشر لـ ChREBP: الأدوار المحددة والأهداف المستقبلية .Cell Metab. 2017 ؛ 26 (28768172): 324-34110.1016/j.cmet.2017.07.004Abstract النص الكامل PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar، 12Baraille F. Planchais J. Dentin R. Guilmeau S. Postic C. دمج ChREBP - بوساطة استشعار الجلوكوز في استقلاب الجسم كله. علم وظائف الأعضاء. 2015 ؛ 30 (26525342): 428-43710.1152/physiol.000165Crossf PubMed Scopus (32) Google Scholar، 13 KIuka. نقل عامل الكربوهيدرات- البروتين الملزم (ChRB): الارتباط المحتمل بين المرض الاستقلابي والسرطان. Biophys. Acta. 2017; 1863 (27919710): 474-48510.1016/j.bbadis.2016.11.029Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar). في الواقع، تعزز بيئة HG نقل ChREBP إلى النواة، مما يؤدي إلى تكوين مركب غير متجانس مع MLX (البروتين الشبيه بالحد الأقصى X) والارتباط بعناصر استجابة الكربوهيدرات (ChoRE) للجينات المستهدفة لـ ChREBP في النواة (14Ma L. Tsatsos N.G. Towle H.C. الدور المباشر لـ ChREBP· Mlx في تنظيم الجينات الكبدية المستجيبة للجلوكوز.J. Biol. Chem. 2005; 280 (15664996): 12019-1202710.1074/jbc.M413063200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 15Stoeckman A.K. Ma L. Towle H.C. Mlx هو الشريك الوظيفي غير المتجانس لبروتين ربط عناصر استجابة الكربوهيدرات في تنظيم الجلوكوز لجينات الإنزيم الدهني.J. Biol. Chem. 2004; 279 (14742444): 15662-1566910.1074/jbc.M311301200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (154) Google Scholar, 16Merla G. Howald C. Antonarakis S.E. Reymond A. يتم تنظيم التوطين تحت الخلوي لبروتين ربط ChoRE، المشفر بواسطة جين المنطقة الحرجة لمتلازمة ويليامز- بورين 14، بواسطة 14-3-3.Hum. مول. جينيت. 2004 ؛ 13 (15163635): 1505-151410.1093/hmg/ddh163Crossref PubMed Scopus (54) الباحث العلمي من Google). في الدراسة الحالية، نظهر أنه استجابة لوسط HG، يمكن لـ ChREBP تجنيد أعضاء آخرين في شبكة ChREBP، بما في ذلك MLX و MAX (العامل المرتبط بـ Myc) و MXD1 (أقصى بروتين ثنائي 1) و HDAC1 (هيستون deacetylase 1)، إلى عنصر ChoRE و E - box المجاور (صندوق المحسن) في مروج Tug1، قمع النشاط النصي. يقع جين lncRNA TUG1 البشري (التسلسل المرجعي NCBI NR _110492 النسخة المتغيرة 1) على الكروموسوم 22q12.2 ويحتوي على 8 نسخ متغيرة، تتراوح بين 5.2–7.6 كيلو باز في الطول، في حين يقع موضع Tug1 lncRNA الفأري على الكروموسوم 11 ويحتوي على ثلاثة نسخ متغيرة (أ، ب، ج) طولها 4.1-6.7 كيلو باز (الشكل 1A). لدى مروج Tug1 نشاط نسخ في المختبر في كلا الاتجاهين ويعمل كمروج ثنائي الاتجاه يقود التعبير عن جين ترميز البروتين Morc2a أيضًا (4Zhao Y. Li H. Fang S. Kang Y. Wu W. Hao Y. Li Z. Bu D. Zhang M.Q. Chen R. NONCODE 2016: مصدر بيانات مفيد وقيم لـ RNAsNucleic Acids Res. 2016 ؛ 44 (26586799): D203 - D20810.1093/nar/gkv1252Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar، 17Derrien T. Johnson R. Bussotti G. Tanzer A. Djebali S. Tilgner H. Guernec G. Merkel A. Knowles D. G. Lagarde J. Veeravalli Luan Ruan Ruan Ruan Lassman T. et al. G.CODE المحفّز البشري لـ RNAs: بنية تحليلهم للتطور الجيني، 2012Genome، 2295159-17593Cr. 18591)، A. G. G. G. Markel D. Knowles D. Lagarde J. Lagard J. V. Veeravalli Luan Ruan Ruan Ruan Rassman Lassman L. T. Al. G. G. G. G. ENDE VEN 7 المحفّز البشري: بنية تحليلهم للتطور الجيني، G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. G. D. G. G. G. D. G. D. G. D. D. D. G. D. D. G. D. D. D. D. G. G. D. D. D. G. D. G. D. G. A. G. D. G. G. D. G. A. A. D. D. D. A. A. D. G. G. A. D. D. D. A. D. A. D. D. G. D. D. A. D. D. D. A. A. D. D. D. D. D. D. A. D. A. A. D. D. T. T. D. D. D. T. T. T. T. T. T. T. T. D. T. T. T. D. T. T. T. D. T. T. T. T. D. T. T. T. T. T. T. T. D. D. T. G. T. T. T. T. T. T. N. N. N. T. T. N. T. N. N. T. T. T. N. T. N. T. T. T. T. T. N. T. N. N. T. T. T. T. N. N. N. T. N. N. T. T. N. T. T. N. N. N. T. T. N. N. N Natl. Acad. Sci. US A. 2013; 110 (23382218): 2876-288110.1073/pnas.1221904110Crossref PubMed Scopus (307) Google Scholar). تماشياً مع الميزة الكلاسيكية للمروجين ثنائيي الاتجاه، حيث يتم فصل مواقع بدء النسخ (TSS) للجينين بشكل متوقع بأقل من 1 كيلوبايت، يتم فصل Morc2a TSS بمقدار 374 نقطة أساس فقط عن Tug1 TSS. والأهم من ذلك، أن Tug1 محفوظ بشكل كبير بين الأنواع ويظهر نمطًا عريضًا للتعبير عن الأنسجة في الفئران والجرذان والبشر (الشكل 1B) (4Zhao Y. Li H. Fang S. Kang Y W. Hao Y. Li Z. Bu D. Sun N. Zhang MQ Chen R. NONCODE 2016: مصدر بيانات مفيد وقيّم لـ RNAsNucleic Acids Res. 2016; 44 (26586799): D203-D20810.1093/nar/gkv1252Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar, 19Fagerberg L. Hallström B.M. Oksvold P. Kampf C. Djureinovic D. Odeberg J. Habuka M. Tahmaseboor S. Danielsson A. Edlund K. Asplund A. Sjöstedt E. Lundberg E. Szigyarto C. A. K. Skogs M. et al. تحليل التعبير الخاص بالنسيج البشري عن طريق دمج علم النسخ والبروتينات القائمة على الأجسام المضادة على نطاق الجين. الخلية. علم البروتينات. 2014 ؛ 13 (24309898): 397-40610.1074/mcp.M113.035600Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1405) Google Scholar). علاوة على ذلك، يتم إثراء موضع Tug1 بالسمات الرئيسية للنسخ النشط، مثل مناطق الكروماتين المفتوحة التي تحتوي على عوامل النسخ وتعديلات الهيستون، بما في ذلك H3 lysine 4 - trimethylation (H3K4me3) و H3K36me3 (الشكل 1A)، مما يشير إلى النسخ النشط على طول جسم جين Tug1. في السابق، حددنا Tug1 على أنه lncRNA يتم تقليل تنظيمه في بيئة مرض السكري باستخدام تحليل تسلسل RNA غير متحيز (RNA - Seq) لكبيبات الكلى (6Long J. Badal S.S. Ye Z. Wang Y. Ayanga B.A. Galvan D.L. Green N.H. Chang B.H. Overbeek P.A. Danesh F.R. ينظم RNA Tug1 طويل غير مشفر الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في اعتلال الكلى السكري.J. Clin. التحقيق. 2016 ؛ 126 (27760051): 4205-421810.1172/JCI87927Crossref PubMed Scopus (188) الباحث العلمي من Google). هنا، توسعنا في ملاحظاتنا السابقة، ووجدنا انخفاضًا كبيرًا في تعبير Tug1 في العديد من سلالات خلايا الكلى التي تم استزراعها في ظل ظروف HG، بما في ذلك الخلايا القرنية (الشكل 1C)، الخلايا الأنبوبية TCMK -1 (الشكل. 1D)، وخلايا هيلا (الشكل 1E). والجدير بالذكر أن جميع الأشكال المتماثلة الثلاثة لنصوص Tug1 قد تم تنظيمها تحت حالة HG في podocyte (الشكل S1). لقد تحققنا أيضًا من أن الخلايا القرنية المعزولة من كلى الفئران التي تعاني من نقص في مستقبلات اللبتين (db/db)، وهو نموذج راسخ لمرض السكري من النوع 2، أظهرت انخفاضًا كبيرًا في تنظيم تعبير Tug1 مقارنة بالخلايا القرنية التي تم الحصول عليها من الفئران غير المصابة بداء السكري (db/m) (الشكل. 1F). جادلنا بعد ذلك بأن خفض تنظيم Tug1 يمكن أن يكون بسبب تضاؤل نشاط النسخ أو تعزيز تدهور الحمض النووي الريبي في ظل ظروف الجلوكوز العالي. لذلك، راقبنا وفرة Tug1 RNA عن طريق RT - PCR الكمي في وجود الأكتينومايسين D، الذي يتداخل في الحمض النووي، ويشكل مجمعًا مستقرًا وبالتالي يمنع نسخ الحمض النووي الريبي الجديد (الشكل 1G). وجدنا أن معدل تدهور الحمض النووي الريبي لم يكن مختلفًا بشكل كبير بين الخلايا المستزرعة في ظل ظروف HG أو NG. تشير هذه النتيجة إلى أن معدل تدهور القاطرة 1 كان متشابهًا في الخلايا القرنية سواء كانت مزروعة في ظل ظروف HG أو NG وتشير إلى أن تنظيم القاطرة 1 بوساطة HG كان أساسًا بسبب تنظيمها النسخي. نظرًا لأن النتائج السابقة أشارت إلى أن مروج Tug1 يعمل كمروج ثنائي الاتجاه يقود تعبير Morc2a، فقد حددنا أيضًا ما إذا كان HG له نفس التأثير على تعبير Morc2a. وتحقيقا لهذه الغاية، تعرضت الخلايا القرنية المستزرعة لهرمون النمو لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة (الشكل 1H). على عكس جين Tug1 المجاور لها، والذي يتم نسخه في خيط معاكس، وجدنا أن HG يثبط بشكل متواضع التعبير عن Morc2a في 48 ساعة ولكن ليس في 24 ساعة. من ناحية أخرى، لم يكن لعلاج HG تأثير كبير على تعبير الحمض النووي الريبوزي المرسال MORC2 في خلايا هيلا (الشكل 1I). تشير هذه النتائج إلى أن HG ليس له تأثير ثابت على تعبير Morc2a. لمزيد من استكشاف كيفية تنظيم HG لنسخ Tug1، استرجعنا منطقة المروج لجين Tug1 الفأري لتحديد مواقع الربط المحتملة لعوامل النسخ. أشارت محاذاة تسلسلات معزز القطر 1 للفئران والبشر والجرذان إلى أن هذه التسلسلات محفوظة بشكل كبير، مع تطابق أكثر من 90 ٪ من التسلسلات بين هذه الأنواع الثلاثة (الشكلين 2a - c). باستخدام أداة على شبكة الإنترنت، rVista 2.0، حددنا العديد من مواقع الربط المحتملة لعوامل النسخ (الشكل 2 ب). وجدير بالذكر أننا وجدنا العديد من مواقع ربط المرشحين p53 بالإضافة إلى مواقع ربط SP1 و YY1 و E47 و IRF -3 و PPAR - α. والأهم من ذلك، وجدنا أيضًا تسلسل إجماع ChoRE واحد في هذه المنطقة كان متطابقًا تقريبًا في الأنواع الثلاثة التي قمنا بتحليلها (الشكل 2B و C). تطابق تسلسل ChoRE جيدًا مع فكرة الإجماع حيث يتم فصل صندوقين E (CAYGYG و CRCRTG) بواسطة 5 نيوكليوتيدات (حيث تشير Y إلى البيريميدين [C أو T] وتشير R إلى البيورين [A أو G]) (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. عامل نسخ مستجيب للجلوكوز ينظم استقلاب الكربوهيدرات في الكبد. Natl. Acad. U. S. 2001; 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 20Jeong YS Kim D. Lee YS Kim H.J. Han JY. Im S.S. Chong H.K. Kwon JK. Cho Y.H. Kim W.K. Osborne T.F. Horton J.D. Jun H.S. Ahn Y.H. Ahn S.M. et al.Integrated expression profiling and genome - wide analysis of ChREBP targets reveals the dual role for ChREBP in glucose - Regulated gene expression.PLoS ONE. 2011; 6 (21811631): e2254410.1371/journal.pone.0022544Crossref PubMedopus (94) Google Scholar, 21Poungarvin N. Changura Chen J. Msuwan K. K. Li - Lie L. L. L. Genome - wide analysis of binding gene sites on male adromose and white adocrose 156.End37 (25811631): e2254410.1371/journal.pone.0022544444Crossf PubMedopus (244). Chem. 2006; 281 (16885160): 28721-2873010.1074/jbc.M601576200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (281) Google Scholar). كان تحديد ChoRE كعنصر توقيع محتمل في المنطقة ذا أهمية كبيرة بالنسبة لنا، لأن التقارير السابقة أظهرت أن ChoRE معترف به من قبل عامل النسخ ChREBP، وهو عامل نسخ رئيسي يتم تنظيمه في ظل ظروف HG (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J. Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. عامل نسخ مستجيب للجلوكوز ينظم استقلاب الكربوهيدرات في الكبد. Natl. Acad. Sci. U. S. 2001; 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 11Abdul - Wahed A. Guilmeau S. Postic C. Sweet sixteenth for ChREBP: established roles and future goals.Cell Metab. 2017; 26 (28768172): 324-34110.1016/j.cmet.2017.07.004Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar). ثم فحصنا ما إذا كان مروج Tug1 يعمل كموقع ربط ChREBP من خلال الاستفادة من بيانات ChIP - Seq على مستوى الجينوم (ChIP إلى جانب تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية) من إحدى دراساتنا السابقة للأنسجة الدهنية (21Poungvarin N. Chang B. Imamura M. Chen J. Moolsuwan K. Sae - Lee C. Li W. Chan L. تحليل على مستوى الجينوم لمواقع ربط ChREBP على كبد الفئران الذكور والكروماتين الدهني الأبيض. علم الغدد الصماء. 2015 ؛ 156 (25751637): 1982-199410.1210/en.2014-1666 Crossref PubMed Scopus (47) الباحث العلمي من Google). باستخدام التحليل القائم على النموذج لـ ChIP - Seq (MACS) (23Zhang Y. Liu T. Meyer C.A. Eeckhoute J. Johnson D.S. Bernstein B.E. Nusbaum C. Myers R.M. Brown M. Li W. Liu X.S. التحليل القائم على النموذج لـ ChIP - Seq (MACS). Genome Biol. 2008 ؛ 9 (18798982): R13710.1186/gb-2008-9-9-r137Crossref PubMed Scopus (6659) الباحث العلمي من Google)، اكتشفنا ذروة موقع ربط ChREBP عند 324 نقطة أساس في المنبع لمروج Tug1 (الشكل 2D). للتحقق ميكانيكيًا من صحة ربط ChREBP بمروج Tug1 في ظل ظروف HG، استخدمنا اختبار ChIP من خلال احتضان المستخلصات النووية للخلايا القرنية المستزرعة المزروعة تحت HG مع جسم مضاد للأرنب ضد ChREBP. كما هو موضح في الشكل 2E، فقط ChREBP - IgG، ولكن ليس أرنب التحكم IgG، الحمض النووي المعزز للكروماتين Tug1 المخصب، والذي تم اكتشافه عن طريق تضخيم PCR، مما يشير إلى أن ChREBP يرتبط بالفعل بمروج Tug1 في ظل ظروف HG. لمزيد من التحقق من صحة ربط ChREBP بمروج Tug1 في الخلايا الحية ولتحديد العوامل التنظيمية التي يمكن أن تشكل معقدًا مع ChREBP للتحكم في تعبير Tug1 في ظل ظروف HG، استخدمنا مزيجًا من استهداف CRISPR ووضع العلامات على القرب مع تقنية أسكوربات بيروكسيداز (APEX2) المهندسة (24Myers S.A. Wright J. Peckner R. Kalish B.T. Zhang F. Carr S.A. اكتشاف البروتينات المرتبطة بمكان جينومي محدد مسبقًا عبر وضع العلامات على القرب بوساطة dCas9 - APEX. الأساليب. 2018 ؛ 15 (29735997): 437-43910.1038/s41592-018-0007-1Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar، 25Lam S.S. Martell JD Kamer KJ Deerinck TJ Ellisman M.H. Mootha V.K. Ting AY. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.Nat. الأساليب. 2015 ؛ 12 (25419960): 51-5410.1038/nmeth.3179Crossref PubMed Scopus (452) Google Scholar، 26Rhee HW Zou P. Udeshi ND Martell JD Mootha VK Carr S.A. Ting AY. رسم الخرائط البروتينية للميتوكوندريا في الخلايا الحية عبر العلامات الأنزيمية المقيدة مكانيًا. العلوم. 2013 ؛ 339 (23371551): 1328-133110.1126/science.1230593Crossref PubMed Scopus (571) Google Scholar). لقد قمنا بتصميم متجه piggyBac للتعبير عن U6 RNA - driven guide RNA (gRNA) الذي يستهدف منطقة مروج Tug1 وبنية اندماج Cas9 (dCas9) - APEX2 الميتة تحت محسن/مروج CMV (27Kaewsapsak P. Shechner D.M. Mallard W. Rinn J.L. Ting A.Y. رسم خرائط الخلايا الحية لـ RNAs المرتبطة بالعضيات عبر الاقتراب الحيوي المقترن بالبروتين RNA crosslinking.Elife. 2017 ؛ 6: e2922410.7554/eLife.29224Crossref PubMed Scopus (68) Google Scholar) (انظر الشكل S2 لتصميم البناء والتسلسل). لقد نقلنا هذا البناء جنبًا إلى جنب مع ترانسبوزاز piggyBac (28Galvan D.L. Kettlun C.S. Wilson M.H. استهداف تكامل ترانسبوسون piggyBac في الجينوم البشري.in: Storici F. تصحيح الجينات: الطرق والبروتوكولات. Humana Press, Totowa, NJ2014: 143-161 Crossref Scopus (3) Google Scholar, 29Kahlig KM Saridey S.K. Kaja A. Daniels M.A. George Jr., A.L. Wilson M.H. Multiplexed transposon - mediated stable gene transfer in human cells.Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 2010; 107 (20080581): 1343-134810.1073/pnas.0910383107Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar) في الخلايا القرنية المستزرعة. كما هو موضح في الشكل 2F، يوجه gRNA بروتين الانصهار dCas9 - APEX2 إلى منطقة معزز Tug1. في وجود H2O2، سيؤكسد APEX2 البيوتين- فينول إلى جذور البيوتين- فينوكسيل (27Kaewsapsak P. Shechner DM Mallard W. Rinn JL Ting AY. رسم خرائط الخلايا الحية للحمض النووي الريبي المرتبط بالعضيات عبر الاقتراب الحيوي المقترن بالبروتين RNA crosslinking.Elife. 2017 ؛ 6: e2922410.7554/eLife.29224Crossref PubMed Scopus (68) Google Scholar، 30Han S. Udeshi ND Deerinck TJ Svinkina T. Ellisman MH Carr S.A. Ting AY. الاقتراب الحيوي كطريقة لرسم خرائط البروتينات المرتبطة بـ mtDNA في الخلايا الحية. الخلية الكيميائية. Biol. 2017; 24 (28238724): 404-41410.1016/j.chembiol.2017.02.002Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (52) Google Scholar). يمكن لجذور البيوتين- الفينوكسيل أن تعلق على البروتينات القريبة (نصف قطر 20 نانومتر) (31Martell J.D. Deerinck T.J. Sancak Y. Poulos T.L. Mootha V.K. Sosinsky G.E. Ellisman M.H. Ting AY. مهندس أسكوربات بيروكسيداز كمراسل مشفر وراثيًا للمجهر الإلكتروني .Nat. Biotechnol. 2012 ؛ 30 (23086203): 1143-114810.1038/nbt.2375Crossref PubMed Scopus (373) الباحث العلمي من Google). استخدمنا حبات الستريبتافيدين المترافقة المغناطيسية لإثراء البروتينات الحيوية في الخلايا القرنية المستزرعة. كعنصر تحكم، استخدمنا خلايا podocytes التي عبرت عن dCas9 - APEX2 باستخدام gRNA غير المستهدف. شرعنا في تقييم البروتينات التي تحتوي على البيوتينيل والتي تحمل علامة dCas9 - APEX2 في منطقة مروج القاطرة 1 المستهدفة بالحمض النووي الريبي. أظهر التكتل المناعي ضد ChREBP أن ChREBP تمت معالجته بيوتينيلياً فقط في الخلايا التي تم نقلها بواسطة gRNA المستهدف من قبل معزز Tug1 ولكن ليس في خلايا التحكم (الشكل 2G). الأهم من ذلك، أكدنا أيضًا أن ChREBP موجود في مروج Tug1 وأن HG يزيد من انتشاره (الشكل 2G). لأن الفأر ChREBP يحتوي على نوعين مختلفين من النسخ (61Herman M.A. Peroni OD. Villoria J. Schon M.R. Abumrad N.A. Bluher M. Klein S. Kahn B.B. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic glucose metabolism.Nature. 2012; 484 (22466288): 333-33810.1038/nature10986Crossref PubMed Scopus (361) Google Scholar), ChREBP - α and ChREBP - β (الشكل 3 أ)، قمنا بعد ذلك بفحص أي شكل متساوي يستجيب لـ HG في خط خلايا الخلايا القرنية. باستخدام RT - PCR الكمي والأشغال التمهيدية الخاصة بالإيزوفورم، وجدنا أن نسخة ChREBP - α فقط هي التي يتم تنظيمها في ظل ظروف HG (الشكل 3B). لاستكشاف وظيفة ChREBP في نسخ القاطرة 1 في المختبر، أنشأنا بنية تعبير لوسيفيراز مدفوعة بمروج القاطرة 1 كيلو بايت ونقلناها مع بنية تعبر عن WT ChREBP - α. في اختبار مراسل لوسيفيراز، كان للخلايا المستزرعة المنقولة بالعدوى بناقل تحكم pGL4 قراءات لوسيفيراز ضئيلة (الشكل 3C)، لكن الناقل الذي يحتوي على معزز القطر 1 كيلو بايت أعطى نشاطًا كبيرًا لإنزيم لوسيفيراز. تم قمع هذا النشاط المعزز عن طريق النقل المشترك مع بنية ChREBP - α cDNA بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 3C)، مما يشير إلى أن ChREBP يمكن أن يقمع نسخ Tug1. باستخدام فحوصات مراسل لوسيفيراز في خلايا القدم، قمنا أيضًا بمقارنة تأثير شكلين متساويين من ChREBP على نسخ Tug1 ووجدنا أن ChREBP - β أقل فعالية بكثير لقمع نسخ Tug1 من ChREBP - α (الشكل S3A). علاوة على ذلك، وجدنا أن عامل النسخ p53 ينشط بشكل كبير، في حين أن YY1 يقمع، نسخ Tug1 (الشكل. S3B)، بما يتفق مع وجود مواقع ملزمة بتوافق الآراء لعوامل النسخ هذه في منطقة المروج (الشكل 2B) والتقارير السابقة حول تحريض تعبير Tug1 بواسطة الصفحة 53 (32Guttman M. Amit I. Garber M. French C. Lin MF Feldser D. Huarte M. Zuk O. Carey b.w. Cassady J.P. Cabili M.N. Jaenisch R. Mikkelsen T.S. Jacks T. Hacohen N. et al. يكشف توقيع الكروماتين عن أكثر من ألف RNA كبير غير مشفر محفوظ بدرجة عالية في الثدييات .Nature. 2009 ؛ 458 (19182780): 223-22710.1038/nature07672Crossref PubMed Scopus (2941) الباحث العلمي من Google، 33Khalil AM Guttman M. Huarte M. Garber M. Rivea Morales D. Thomas K. Presser A. Bernstein B. E. Van Oudenaarden A. Regev A. Lander E.S. Rinn J. L. يرتبط العديد من الحمض النووي الريبي بين الجينات الكبيرة بين الجينات بتعقيدات تعديل الكروماتين والتعبير الجيني. Natl. Acad. Sci. US 2009; 106 (19571010): 11667-1167210.1073/pnas.0904715106Crossref PubMed Scopus (2172) Google Scholar). نظرًا لوجود نوعين محتملين من ChoREs في منطقة المروج لجين Tug1 الفأري، فقد أنشأنا أيضًا العديد من بنيات متحولة ChoRE حيث تم تقصير فاصل 5 نيوكليوتيدات (NT) بين زخارف التكرار المباشر (DR1) إلى 4 NT التي يجب أن تلغي ربط ChREBP إما بـ ChoRE1 أو ChoRE2 (10Yamashita H. Takenoshita M. Sakurai M. Bruick R.K. Henzel W.J Shillinglaw W. Arnot D. Uyeda K. عامل نسخ مستجيب للجلوكوز ينظم استقلاب الكربوهيدرات في الكبد. Natl. Acad. Sci. الولايات المتحدة الأمريكية 2001 ؛ 98 (11470916): 9116-912110.1073/pnas.161284298Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar، 34Shih H.M. Liu Z. Towle H.C. اثنين من زخارف CACGTG مع تباعد مناسب تملي تنظيم الكربوهيدرات لنسخ الجينات الكبدية. J. Biol. Chem. 1995; 270 (7665621): 21991-2199710.1074/jbc.270.37.21991Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar). فشل ChoRE1 المتحول (mut1) في إظهار قمع نشاط مروج القاطرة 1 (الشكل 3D). أظهرت الطفرة المزدوجة (الطفرة 3) التي حدث فيها حذف نيوكليوتيد واحد في كل من ChoRE1 و ChoRE2 نشاطًا معززًا مشابهًا لنشاط طفرة ChoRE1. على النقيض من ذلك، أظهرت ChoRE2 الطافرة (mut2) نفس مستوى نشاط المحفز مثل WT (الشكل 3D). تشير هذه النتائج إلى أن ChoRE1، ولكن ليس ChoRE2، يلعب دورًا مهمًا في قمع تعبير Tug1 بوساطة ChREBP. كما استخدمنا أساليب فقدان الوظيفة وكسب الوظيفة لفحص دور ChREBP في التنظيم النسخي لجين Tug1. لقد أسقطنا أولاً تعبير ChREBP بواسطة shRNA في الخلايا القرنية (الشكل 3E). تماشياً مع ملاحظاتنا السابقة، وجدنا أن الضربة القاضية لـ ChREBP أدت إلى تعزيز التعبير عن Tug1 وجينها المستهدف النهائي، Pgc1α. وقد أظهرت كفاءة الضربة القاضية عن طريق النشف الغربي (الشكل 3E). على العكس من ذلك، أدى التعبير المفرط عن ChREBP إلى قمع كل من جينات Tug1 و Pgc1α (الشكل 3F). تشير هذه النتائج إلى أن lncRNA Tug1 هو جين مستهدف لعامل النسخ ChREBP. من المعروف أن ChREBP يرتبط بـ ChoRE بعامل نسخ آخر، MLX، شريك ملزم لـ ChREBP، مما يشكل دايمرًا غير متجانس (14Ma L. Tsatsos N.G. Towle H.C. الدور المباشر لـ ChREBP· Mlx في تنظيم الجينات الكبدية المستجيبة للجلوكوز.J. Biol. Chem. 2005; 280 (15664996): 12019-1202710.1074/jbc.M413063200Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 15Stoeckman A.K. Ma L. Towle H.C. Mlx is t