نبذة مختصرة : Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
نبذة مختصرة : The present work is focused on the development and understanding of the applications of novel lipid-based systems for ocular drug delivery in the treatment of Diabetic Retinopathy (DR). The use of cationic lipid nanoparticles encapsulating an antioxidant drug, epigallocatechin gallate (EGCG), is innovative and has been firstly proposed by our research group for ocular administration. The Chapter 1.1 revises the concepts and emphasizes the importance and applications of solid lipid nanoparticles (SLN) as novel drug delivery systems. The chemical structure, production methodology and physicochemical characterization (e.g. particle size, distribution, polymorphic behavior, and crystallization) are widely described along with the biopharmaceutical stability and profile. The Chapter 1.2 revises the DR, as being the major ocular consequence of diabetes. The biochemical and anatomic abnormalities that induces in the microvasculature of the retina affect the eye, leading to vision loss, and contributing to the decrease of patient’s life quality. The conventional treatments, including surgical and pharmaceutical strategies, are discussed and also the new strategies involving nanomedicines based on nanoparticles. Despite the multifactorial nature of DR, targeting approaches to reach the posterior segment of the eye have been considered and seem to achieve promising results. The Chapter 2 reports the development of cationic lipid nanoparticles (LNs) for ocular delivery based on a 33 full factorial design. Three different variables and their influence on the physicochemical properties of the produced LN were analyzed. The cationic lipid, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), was further added to the lipid matrix of the optimal LN dispersion for physical and chemical evaluation, crystallization and polymorphism, and stability. The best formulation with respect to physiochemical stability and safety, was obtained with 4.5 wt% of Softisan®100, 0.5 wt% of CTAB, 0.5 wt % of Lipoid®S75, 37.5 wt % of glycerol and 1.0 wt % of Poloxamer 188. The Chapter 3.1 reports the study of EGCG stability in HEPES and in a mimetic biological medium regarding the pH dependency, storage temperature and in the presence of ascorbic acid, a reducing agent. After stabilization of EGCG, a validation method based on RP-HPLC with UV-Vis detection was carried out for two media: water and a biocompatible physiological medium composed of Transcutol®P, ethanol and ascorbic acid. The Chapter 3.2 reports the encapsulation of EGCG in LNs. Two distinct cationic lipids were used, namely, CTAB and dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB) and the results show that different lipids lead to different characteristics mainly associated with the acyl chain composition, i.e. double tail lipid shows to have influence in the crystallization and stability. Despite the recorded differences between DTAB and DDAB, they both seem to fit the appropriate physicochemical parameters for ocular drug delivery, namely, particle size and size distribution, pH, osmolarity and viscosity. The Chapter 4 reports the biopharmaceutical study of EGCG LNs. The in vitro release of EGCG LNs by dialysis bag following the analysis by a validated RP-HPLC method showed a prolonged EGCG release following a Boltzmann sigmoidal profile. Also, the ex vivo transcorneal and transscleral permeation assay in Franz diffusion cells revealed the capacity of EGCG to permeate ocular tissues. The pharmacokinetic study of the corneal permeation showed a first order kinetics for both cationic formulations, while EGCG-CTAB LNs followed a Boltzmann sigmoidal profile and EGCG-DDAB-LNs a first order profile for transscleral permeation. Thus, the developed EGCG-LNs revealed to be non-irritant and safe for ocular delivery, as demonstrated by HET-CAM and Draize tests. The Chapter 5 reports the influence of the LNs developed and EGCG in the cell viability and antioxidant enzymatic activity of Y-79 retinoblastoma cells. The activity of superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase and glutathione-S-transferase seems to decrease, indicating the inability to neutralize the ROS formation and thus, leading to oxidative stress. Also, the lipids and proteins oxidation was increased which is related to the decreased enzymatic activity. The DDAB-LNs was the only formulation with improved enzymatic protection regarding the cell viability, antioxidant enzymatic activity and protection against lipids and proteins oxidation. It is therefore possible to associate the EGCG chelating effect with lower availability of the drug for exerting their proven antioxidant effects. Also, the EGCG was found not prevent lipid peroxidation but has been more efficient in preventing proteins oxidation. This thesis is finalized with the general conclusions obtained by the curation of the data presented and discussed in the previous chapters, and are comprehensively summarized in the Chapter 6.
O presente trabalho relata o desenvolvimento e compreensão da aplicação de inovadores sistemas terapêuticos lipídicos para a entrega de fármacos por administração ocular no tratamento da Retinopatia Diabética (RD). O uso de nanopartículas de lípidos catiónicas encapsulando um fármaco anti-oxidante, galato de epigalocatequina (EGCG), é inovadora e foi proposta pela primeira vez, para fins oculares, pelo nosso grupo de investigação. O Capítulo 1.1 revê os conceitos e enfatiza a importância e aplicações de nanopartículas de lípidos sólidos (SLN) como novos sistemas terapêuticos. A estrutura química, metodologia de produção e caracterização físico-química (por exemplo, tamanho de partícula, distribuição, comportamento polimórfico, e cristalização) são descritos, assim como a sua estabilidade e perfil biofarmacêutico. O Capítulo 1.2 revê a RD como a principal consequência da diabetes a nível ocular. As alterações bioquímicas e anatómicas induzidas na microvasculatura da retina afecta os olhos, levando à perda da visão, e contribuindo para a diminuição da qualidade de vida dos pacientes diabéticos. São abordados os tratamentos convencionais, incluindo estratégias cirúrgicas e farmacêuticas, assim como as novas estratégias que envolvem nanopartículas. Apesar da natureza multifactorial da RD, novas estratégias para o direccionamento activo ao segmento posterior do olho, têm sido consideradas com a obtenção de resultados promisores. O Capítulo 2 relata o desenvolvimento de nanopartículas lipídicas (NLs) catiónicas para administração ocular baseado num desenho factorial completo 33. Foram avaliadas três variáveis e a sua influência sobre as propriedades físico-químicas das NLs. Um lípido catiónico, o brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB), foi adicionado à matriz lipídica da NL optimizada para avaliação das propriedades físico-químicas. A formulação produzida mais adequada relativamente à sua estabilidade físico-química e segurança foi obtida com 4,5 p/p % Softisan®100, 0,5 p/p % CTAB, 0,5 p/p % Lipoid®S75, 37,5 p/p % glicerol e 1,0 p/p % poloxâmero 188. O Capítulo 3.1 relata o estudo de estabilidade de EGCG em HEPES e num meio biológico mimético relativamente à dependência do pH, temperatura de armazenamento e na presença ou não de um agente redutor, o ácido ascórbico. Após a estabilização da EGCG, foi desenvolvido um método de validação RP-HPLC com detecção UV-Vis em dois meios: em água e num meio fisiológico biocompatível composto por Transcutol®P, etanol e ácido ascórbico. O Capítulo 3.2 relata a encapsulação de EGCG em NLs como um sistema inovador para administração ocular e para o futuro tratamento de várias doenças, tais como RD. Foram utilizados dois lípidos catiónicos distintos, o CTAB e o brometo de dimetildioctadecilamónio (DDAB), e os resultados demonstram que diferentes lípidos conduzem a características diferentes, principalmente associados com a composição da cadeia de acilo, a cauda dupla mostra ter maior influência na cristalização e estabilidade das NLs. Apesar das diferenças registadas, ambas as formulações parecem adequar-se aos parâmetros para administração ocular no que respeita ao tamanho de partícula e distribuição, pH, osmolaridade e viscosidade. O Capítulo 4 relata o estudo biofarmacêutico das NLs encapsuladas com EGCG. O perfil de libertação in vitro da EGCG através da técnica do saco de diálise foi analisado por RP-HPLC e demonstrou uma libertação prolongada seguindo um perfil sigmoidal de Boltzmann. A permeação transcorneal e transscleral ex vivo em células de difusão de Franz revelou a capacidade da EGCG em permear os tecidos oculares. A nível transcorneal, observou-se uma cinética de primeira ordem para ambas as formulações, enquanto a nível transscleral as EGCG-CTAB NLs obedeceram um perfil sigmoidal de Boltzmann e as EGCG-DDAB-NLs um perfil de primeira ordem. Através dos testes de HET-CAM e Draize, as EGCG-NLs demonstraram ser seguras e não irritantes para administração ocular. O Capítulo 5 relata a avaliação da viabilidade celular e da actividade enzimática em células Y-79 de retinoblastoma humano. Verificou-se que a actividade da superóxido dismutase, catalase, glutationa-redutase e glutationa-S-transferase diminuiu, indicando a incapacidade para neutralizar a formação de ROS e, assim, conduzindo a um ambiente de stress oxidativo. Além disso, aumentou a oxidação de lípidos e proteínas, fenómeno que está relacionado com a diminuição da actividade enzimática. A DDAB-NLs foi a única formulação que revelou maior protecção enzimática ao nível da viabilidade celular, da actividade enzimática antioxidante e da oxidação lípidos e proteínas. É, pois, possível associar o efeito quelante ao EGCG, o que poderá reduzir a sua disponibilidade para exercer os seus efeitos antioxidantes comprovados. Além disso, o EGCG parece não impedir a peroxidação lipídica, mas parece ser mais eficiente evitando a oxidação de proteínas. Esta tese finaliza com as conclusões gerais resultantes do tratamento dos dados apresentados e discutidos nos capítulos antecedentes, e que são compreensivamente sumarizados no Capítulo 6.
FCT - SFRH/BD/80335/2011
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