Anàlisi, presència i persistència de plaguicides en rius de les principals conques mediterrànies

El continu creixement demogràfic de la població en l'últim segle ha creat la necessitat d'incrementar la producció d'aliments. No obstant això, les plagues i malalties destrueixen prop de la tercera part de les collites durant la seua producció, transport i emmagatzematge. Davant aquestes circumstàncies la utilització de plaguicides que controlen l'acció de les plagues és imprescindible.[1] La utilització de productes fitosanitaris ha aportat indiscutibles beneficis econòmics ja que augmenten la productivitat agrícola, i disminueixen la mà d'obra així com també el cost dels aliments. Junt amb els avantatges derivats del seu ús agrícola, la utilització de plaguicides també ha beneficiat el camp de la sanitat, on han contribuït al control i, fins i tot, l’eradicació en algunes zones de malalties transmeses per vectors [2]. A tot això, si afegim que la seua síntesi és econòmica, la seua estabilitat química excel•lent i el seu risc toxicològic per a la salut humana i el medi ambient s'ha evidenciat relativament tard, que, a més a més, ha provocat el seu ús massiu i indiscriminat. [3] Els plaguicides no són selectius a la plaga que pretenen controlar, i afecten no solament als vectors relacionats amb aquesta, sinó que també a altres espècies, provocant desequilibris en els ecosistemes. A partir dels estudis realitzats als Estats Units d'Amèrica (EUA), dels 500 milions de quilos de plaguicides utilitzats anualment només l'1 % dels productes arriba als organismes nocius als quals van destinats. El 99 % restant roman en els ecosistemes, es transfereixen a l'atmosfera per volatilització, al sòl i als aqüífers [4]. Si bé els productes fitosanitaris augmenten la producció d'aliments, els efectes negatius en el medi ambient són indiscutibles. Des de les aigües superficials els plaguicides entren en els nivells més baixos de la cadena alimentària en concentracions baixes, es van bioacumulant en cada nivell tròfic i es biomagnifiquen successivament fins a arribar a la part més alta de la cadena tròfica (aus rapaços, peixos o mamífers depredadors), on aconsegueixen concentracions entre 10 y 100 vegades més altes que les originals. Aquesta bioacumulació afecta la biodiversitat ocasionant una disminució en les seues poblacions, ja que tots els integrants de la cadena tròfica estan exposats a concentracions subletals que provoquen efectes en els individus que poden anar des d'indetectables fins a seriosos danys que afecten la seua reproducció i supervivència. Els productes químics que es troben en els fitosanitaris penetren en les vies fluvials per efecte de la difusió de la polvorització. El grau i extensió de la difusió depén de factors climàtics externs com la temperatura ambient i el règim de pluges i de vents. La pluja mobilitza els plaguicides del lloc on es van aplicar per fenòmens d'escolament superficial o per infiltració a través del sòl cap a les aigües subterrànies. Igual que la pluja, el reg incrementa el grau de lixiviació disminuint la quantitat de plaguicida que es volatilitza des del sòl. Un excés de reg pot percolar els plaguicides directament en l'aqüífer. Part dels plaguicides s'evaporen passant a l'aire o unint-se a les partícules del sòl, com a vapor o com a pols. Poden ser transportats grans distàncies i novament ser depositats sobre la terra o aigües superficials a través de les pluges. En les últimes dècades, ha augmentat la preocupació per la conservació dels recursos naturals des d'una perspectiva sostenible i la disponibilitat de l'aigua s'ha convertit en una qüestió important que preocupa tots els governs. Esta contaminació generalitzada dels ecosistemes aquàtics i del sòl ha obligat a l'adopció de mesures legislatives restrictives per part de la Unió Europea: • Directiva Marc de l'Aigua (DMA) (Directiva 2000/60/CE), estableix les bases per a regular els recursos hídrics amb l'objectiu de preservar, protegir i millorar la seua qualitat i el seu ús sostenible [5]. • Decisió 2455/2001/CE, estableix una llista de 33 substàncies prioritàries que han de ser controlades, la tercera part de les quals són plaguicides [6]. • Directiva 2008/105/CE defineix les normes de qualitat ambiental (NQA), mitjana anual (MA) i concentracions màximes admissibles (CMA) en les aigües superficials per a la llista de substàncies prioritàries abans mencionades. Encara que diversos plaguicides estan inclosos actualment en esta llista en els reglaments de la Unió Europea (UE), molts altres encara no estan regulats [7]. • Directiva 98/83/CE, estableix límits per als plaguicides en les aigües destinades al consum humà (100 ng/L per als plaguicides individuals i 500 ng/L per a la suma de tots els plaguicides) [8]. Les conques hidrològiques mediterrànies estan sotmeses principalment a pressions que provenen de l'expansió i el desenvolupament humà en les seues diferents expressions (agrícola, industrial, urbà...). Els models de canvi climàtic conclouen que les regions mediterrànies seran les més impactades en els pròxims anys i les conseqüències del canvi global afectaran tant a la disponibilitat com a la qualitat de l'aigua. Encara que aquests contaminants es troben generalment a nivell de traça en els ambients aquàtics, és important conéixer la seua distribució i evolució en el medi ambient per al seu control i evolució, ja que l'exposició crònica a aquestes dosis baixes pot suposar una amenaça per a la biota aquàtica i la salut humana [9]. Tot el que hem dit fins ara posa de manifest que l'anàlisi de residus de plaguicides representa un instrument fonamental per a la protecció humana i del medi ambient. Aquesta circumstància, crea la necessitat de realitzar un major esforç en el desenvolupament de metodologies ràpides i versàtils que permeten la detecció de contaminants emergents i els seus possibles metabòlits en matrius mediambientals [10]. Els estudis sobre la incidència dels contaminants emergents en la Península Ibèrica són escassos [11-16]. En general, a Europa hi ha pocs estudis que determinen l'aparició dels plaguicides utilitzats en l'actualitat en els distints compartiments ambientals diferents de l'aigua i la majoria d'ells són mostrejos erràtics realitzats per a demostrar la fiabilitat d'un mètode d'anàlisi, però no estudis sistemàtics que avaluen la incidència i els nivells de plaguicides en una conca hidrogràfica [17-20]. Aquests estudis, tot i que no tenim molts antecedents, són més freqüents als EUA [21-28]. L'escàs nombre de publicacions relacionades amb la presència de plaguicides en sediments i biota són a conseqüència, en part, de la falta de NQA per als contaminants orgànics en aquestes matrius, inclosos els plaguicides i a la dificultat de la seua extracció. Els sediments i els peixos són matrius variables i molt complexes, a causa de les fortes interaccions que enllacen els anàlits amb els diferents constituents de la mostra (matèria orgànica i argiles en sediments; greixos i proteïnes en els peixos), convertint a aquestes dues matrius en un dipòsit d'aquests compostos i dificultant la seua extracció [29]. Atenent a les necessitats mediambientals existents es va definir l'objectiu global d'aquesta tesi doctoral, basada en oferir una visió general de la qualitat de les aigües de les conques mediterrànies representatives de la Península Ibèrica, així com l'avaluació del risc toxicològic dels plaguicides sobre la biota (algues i bacteris, macroinvertebrats i peixos). Tot i això, aquesta tesi doctoral pretén contribuir al coneixement de la funcionalitat de les conques mediterrànies, i de la seua capacitat de recuperació enfront de l'impacte de les activitats humanes, a més a més, de ser útil com una base sòlida per al desenvolupament i la planificació d'estratègies i metodologies més adequades per a la recuperació i protecció dels ecosistemes mediterranis distribuïts per tot el planeta, prenent com a cas d'estudi la presència de residus de plaguicides. Per tant, la metodologia utilitzada en l'elaboració d'aquesta tesi és: 1. Desenvolupament i validació de metodologies analítiques basades en l’extracció en fase sòlida (SPE), la metodologia QuEChERS (acrònim de Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) i l’extracció amb líquids pressuritzats (PLE) seguida de cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS), utilitzant un analitzador de triple quadrupol així com quadrupol temps de vol, per a la determinació de plaguicides en mostres d'aigua, sediments i peixos. 2. Estudiar les concentracions, distribució i destí d'aquests contaminants en ecosistemes fluvials mediterranis de la Península Ibèrica (Guadalquivir, Llobregat i Túria) tractant de determinar l'origen i el patró de distribució d'aquests compostos. 3. Avaluar l'amenaça que suposen aquests compostos per a la fauna aquàtica, basat en les dades toxicològiques disponibles de plaguicides. Els organismes diana pertanyien als tres nivells de la cadena tròfica, per a obtindré una imatge completa del potencial d'impacte d'aquestes substàncies per al medi aquàtic. Per al seu desenvolupament, les publicacions que conformen aquesta tesi s'han distribuït en 9 capítols que es poden agrupar en tres blocs: • Capítols 1-5, enfocats a la posada a punt dels mètodes analítics que resolguen els reptes que dificulten l'anàlisi de residus de plaguicides. • Capítols 6-8, basats en l'aplicació de la metodologia anteriorment desenvolupada sobre diversos ecosistemes fluvials mediterranis de la Península Ibèrica, a través d'una enquesta de seguiment realitzada en les campanyes 2010 i 2011, en què es van analitzar més de 40 plaguicides emprats en l'actualitat. Per tal d’avaluar els principals factors d'estrés d'aquestes conques es va establir una xarxa de punts de mostreig representatius que cobrien les zones més afectades des del punt de vista de la indústria química, hidrològic, morfològic i ecològic, així com els llocs de referència en els quals s'esperava major qualitat. • Capítol 9 se centra en l'estudi de models sobre el comportament dels plaguicides en les conques mediterrànies. A continuació, detallrem l'objectiu de cada capítol: El capítol 1 és la introducció general en la qual abordarem diferents aspectes. En primer lloc oferirem una visió crítica de l'actual flux de treball dins de l'anàlisi de residus de plaguicides per LC-MS, perquè moltes de les revisions que tracten aquest tema són més generals i se centren en altres tipus de tècniques, a més de LC-MS. També prestarem especial atenció a proporcionar una cobertura completa de les últimes innovacions dins d´aquest camp. Finalment, analitzarem breument les possibles tendències futures i desenvolupaments en aquesta àrea. Dels capítols 2 al 9 recollirem el treball experimental realitzat durant el doctorat, recopilats en forma de publicacions, el qual va ser planificat i dissenyat per tal d’aconseguir els objectius proposats. En el capítol 2 analitzarem més de 60 mostres d'aigües superficials i residuals per LC-triple quadrupol (QqQ)-MS/MS i LC-quadrupol temps de vol (QqTOF)-MS/(MS) després d'una SPE convencional, per tal d´investigar si l'ús combinat dels sistemes és útil en la realització rutinària de la determinació sistemàtica de residus de plaguicides. En el capítol 3 farem un pas endavant en les estratègies analítiques desenvolupades per a l’anàlisi no dirigit quantitatiu i no quantitatiu de contaminants utilitzant l'última generació LC-QqTOF-MS (ABSciex TripleTOFTM5600) mitjançant l'extracció dels ions amb una exactitud de massa de 20 mDa d'acord a una base de dades de més de 2.000 compostos amb informació de massa exacta i, si estan disponibles, els temps de retenció. Un mètode d'informació d'adquisició depenent (IDA) permet obtenir automàticament espectres MS/MS dels ions precursors més intensos (sense selecció prèvia). D'altra banda, per primera vegada, i amb la finalitat d'identificar contaminants rellevants inesperats per als sistemes d'aigua i definir canvis en les empremtes dactilars d'aigua, anàlisi de dades estadístiques utilitzant l'anàlisi de components principals (PCA) i els components principals agrupació variables (PCVG), es va combinar amb càlcul de la fórmula empírica, cercada en base de dades en línia (chemspider o altres bases de dades d'Internet), i la interpretació de fragments d'ions MS/MS per a detectar amb èxit contaminants desconeguts com una visió dins dels forenses ambientals. Finalment, les capacitats quantitatives del sistema van ser explorades per a 42 plaguicides utilitzats en l'actualitat, la determinació dels quals va ser validada d'acord amb les directrius europees. La possibilitat de limitar l'anàlisi a un sol instrument proporcionarà avantatges en termes d'estalviar temps i costos. En el capítol 4, desenvoluparem un mètode analític per microextracción fase sòlida “en tub” acoblat a cromatografia d'ultra alta pressió- electrospray - espectrometria de masses tàndem (UHPLC-QqQ-MS/MS) per a l´anàlisi multiresidu de nou substàncies prioritàries incloses en la Directiva 2008/105/CE en aigües superficials continentals. Es mostra per primera vegada un procediment que permet aconseguir la selectivitat i la sensibilitat necessària per a determinar contaminants orgànics en mostres d'aigua, mitjançant l´acoblament d´una tècnica que necessita una pressió relativament baixa [prèviament microextracció en fase sòlida en-tub (IT-SPME)], i una altra que opera a una pressió relativament alta (UHPLC). El nou acoblament es compara amb l’establert IT-SPME i Cromatografia Líquida capil•lar (CapLC). En el capítol 5 descriurem, avaluarem i compararem els procediments PLE i QuEChERS per a l'extracció de 50 plaguicides en sòls, sediments i fangs i la seua posterior determinació mitjançant LC-MS /MS. La combinació QuEChERS amb LC-MS/MS, va ser la més avantatjosa i es va aplicar per primera vegada per a determinar els residus de plaguicides en sòls, sediments i fangs de la conca del riu Túria. En el capítol 6 analitzarem les concentracions de plaguicides en l’influent, efluent i fangs deshidratats de les principals estacions depuradores d’aigües residuals (EDARs) situades al llarg dels rius Ebre, Guadalquivir, Xúquer i Llobregat a Espanya. Amb aquestes dades, es calculen i relaten les eficiències d'eliminació d´aquestes EDARs. L´objectiu final d'aquest estudi és millorar el coneixement sobre les causes de la contaminació dels ambients aquàtics considerant les EDARs com a fonts puntuals de contaminants com són els plaguicides. En el capítol 7 monitoritzem la concentració de plaguicides en aigua, sediments i biota (només 2010) de la Conca Hidrogràfica del Guadalquivir. Aquest és el primer estudi pilot dut a terme en aquesta extensa conca hidrogràfica espanyola i té la intenció de millorar el coneixement de la incidència d'aquests plaguicides en el medi ambient aquàtic. Les concentracions dels plaguicides utilitzats en l'actualitat associats als sediments i la biota també poden determinar quins plaguicides tenen més probabilitat de repartir-se en la fase de sediments en suspensió, o de bioacumular-se en la cadena tròfica aquàtica, i aquesta informació serà útil per a altres conques on aquests compostos són aplicats. En el capítol 8 analitzarem les concentracions de plaguicides en mostres d'aigua superficial, efluents d'aigües residuals, sediments i biota (només) al llarg de tot el curs del riu Llobregat i els seus afluents, amb la finalitat d'establir la incidència dels plaguicides i la seua distribució. Els resultats obtinguts en aquest seguiment es van comparar amb les dades històriques recopilades durant altres programes de monitoreig en aquesta conca per a descriure les tendències en l'estat de la qualitat de l'aigua i determinar els riscos potencials per a la salut humana. Aquesta és la primera vegada que (i) es determina un nombre tan elevat de plaguicides a la conca, (ii) s´estudien tres compartiments ambientals (aigua / sediments / biota) i (iii) les dades relacionades amb la incidència dels plaguicides en aquest riu s'han recopilat i comparat d'una manera detallada. A més a més, els resultats d'aquest estudi són àmpliament aplicables a altres conques que segueixen el patró hidrològic dels rius mediterranis i que pateixen l'efecte del canvi climàtic en augment. Finalment, en el capítol 9 identificarem les forces impulsores dels processos involucrats en el moviment de plaguicides en algunes regions italianes i espanyoles. A més a més, es desenvolupen eines per a simular el comportament dels plaguicides a diferents escales amb l´objectiu de definir els permisos d'ús de plaguicides (o restriccions) a nivell regional, planificant programes de seguiment, optimitzant el pressupost dels estudis al centrar el mostreig en les àrees on és probable que es troben les concentracions de plaguicides més altes. Els resultats d'aquesta tesi han contribuït al desenvolupament de mètodes analítics més sensibles i fiables, així com, a l'avanç en el coneixement sobre la distribució d'aquests compostos tòxics en el medi ambient. D'acord amb els objectius de la present tesi doctoral, la recerca duta a terme i els resultats descrits en els capítols previs, podem destacar les següents conclusions: 1. La combinació de cromatografia líquida espectrometria de masses en tàndem utilitzant un triple quadrupol (LC-QqQ-MS/MS) i/o un quadrupol temps de vol (UHPLC-QTOF MS) va resultar viable i eficient per a la determinació sistemàtica de residus de plaguicides. L'analitzador de triple quadrupol (QqQ) és capaç de detectar més plaguicides en les mostres a causa de la seua major sensibilitat, mentre que l'analitzador temps de vol (QTOF MS) permet identificar altres contaminants també presents en les mostres, com són els productes farmacèutics (valsartan i irbersartan), no seleccionats a priori com a compostos diana del mètode. 2. La cromatografia líquida combinada amb un quadrupol temps de vol amb adquisició de l'espectre dels ions producte depenent de la informació (LC-MS-QqTOF en IDA-MS/MS) automatitzada per a l'anàlisi qualitatiu i quantitatiu va permetre la determinació simultània de 43 plaguicides i la identificació d'un gran nombre d'altres plaguicides i compostos farmacèuticament actius no seleccionats en l'anàlisi dirigida en mostres d'aigües residuals i de riu. El mètode és una alternativa simple, ràpida i viable per al control rutinari de contaminants orgànics en aigües, útil per a la detecció d'un nombre il•limitat de contaminants sense necessitat de realitzar diverses anàlisis. 3. La preparació de la mostra mitjançant extracció en fase sòlida és convenient, simple i ràpida i cobreix una gran varietat de substàncies amb diferent polaritat. Totes les mostres analitzades contenien plaguicides, alguns d'ells en concentració superior a 0,5 µg L-1. Aquests resultats posen de manifest la coherència, bona sensibilitat i l'alt poder d'identificació del mètode desenvolupat. 4. L'acoblament de microextracció en fase sòlida “en tub” (IT-SPME) amb cromatografia líquida espectrometria de masses en tàndem (UHPLC-MS/MS) per a la identificació i quantificació de contaminants orgànics en mostres d'aigua va proporcionar bona precisió i reproductibilitat (RSD < 20%), alt factor d'enriquiment (ca. 15) i resposta lineal (r > 0.99). El sistema permet l'enriquiment on-line dels anàlits en el rang de ppt (ng L-1), ja que augmenta la sensibilitat aproximadament 100 vegades en comparació de la injecció directa en el cromatògraf. No obstant això, atés que l'acoblament de l'extracció i la determinació s'ha de realitzar manualment, és menys robust que l'extracció en fase sòlida quan es vol aplicar a la determinació d'un ampli rang de plaguicides (>20). 5. La comparació de l'extracció amb QuEChERS i amb líquids pressuritzats (PLE) per a l'extracció simultània de 50 plaguicides en sòls, sediments i fangs va demostrar que l'eficiència i l'eficàcia del mètode QuEChERS optimitzat per a sediments es superior a la de PLE, permetent reduir el temps i el cost de l'anàlisi, així com augmentar el rendiment. 6. L'estudi de la presència de plaguicides en influents, efluents i fangs deshidratats en les plantes de tractament d'aigües residuals de les principals conques hidrogràfiques espanyoles posa de manifest la presència de plaguicides i la baixa eficàcia en la seua eliminació. A causa d'aquestes baixes eficiències d'eliminació es poden considerar un focus de contaminació puntual de les aigües superficials a causa d'aquests compostos. 7. Es va monitoritzar la presència de plaguicides en mostres d'aigües, sediments i biota en les conques hidrogràfiques del Guadalquivir i el Llobregat durant dos anys consecutius (2010 i 2011). En ambdues, els plaguicides es van detectar principalment en aigua, on van aparéixer quasi contínuament. La seua presència en sediments va ser molt més intermitent i en biota més aviat escassa. Els insecticides organofosforats i els herbicides triazínics van ser els plaguicides predominants en ambdues conques. 8. L'estudi realitzat en el Guadalquivir revela que organofosforats (malatió, clorpirifos, diazinó), carbamats (metiocarb) i triazines (terbutilazina, deisopropilatrazina), van ser les famílies detectades amb major freqüència i concentració en tots dos períodes. Els productes de transformació de la atrazina i la terbutilazina es van trobar en concentracions més altes que els compostos originals, com a resultat del seu llarg procés de degradació. La distribució espacial dels plaguicides va mostrar que els punts de mostreig localitzats a Jaén i Còrdova estan dominats pels insecticides i herbicides utilitzats en el cultiu de l'olivera mentre que els de les altres províncies contenien una mescla complexa de tots els plaguicides estudiats, que reflecteixen les diferències en els patrons de cultiu. 9. Els plaguicides predominants en el Llobregat (en termes de freqüència i concentració) eren bencimidazols (carbendazim), organofosforats (malatió, clorpirifos), triazines (terbutilazina-2-hidroxi, simazina), neonicotinoids (imidacloprid) i triazols (tebuconazol). Els nivells són majors en la confluència dels rius Anoia i Llobregat. Aquesta zona és eminentment agrícola i dedicada al cultiu de la vinya. 10. La comparació dels resultats d'aquest estudi amb dades històriques confirmen l'existència d'una contaminació de fons en la zona del riu Llobregat en els últims 20 anys i demostren que el seguiment periòdic de l'estat de la qualitat ambiental dels rius ajudarà al control de la contaminació i a determinar l'efecte de diferents paràmetres físic-químics. 11. L'estudi de la distribució temporal durant els dos anys del seguiment indica que podria estar relacionada amb el cabal del riu. El flux mitjà-baix comparat amb un flux alt produeix un augment de la concentració en l'aigua i els sediments. En ambdues conques hidrogràfiques diversos plaguicides excedien el límit de 0,1 µg L-1 per als compostos individuals. Els punts de mostreig GUA-3 i ANO-3, localitzats en els rius Guadalquivir i Llobregat respectivament, van excedir el límit de 0,5 µg L-1 per a la suma dels plaguicides en règim de cabal baix-mitjà. 12. Els diferents patrons de contaminació per plaguicides en diferents condicions de flux van revelar que pot afectar a la toxicitat per a la biota. Encara que els valors del quocient de risc (RQ) van mostrar un baix risc de toxicitat per la presència de plaguicides en l'aigua, la bioacumulació de clorpirifos i diazinó, plaguicides lipofíls (Kow> 3) en peixos, destaca la necessitat d'enfocaments alternatius i complementaris als previstos pel simple compliment de les normes de qualitat ambiental (NQA). 13. Es va realitzar un estudi en el riu Túria sobre la possible infiltració de les triazines i urees de les aigües superficials a les aigües subterrànies. Aquestes dades es van confrontar amb els mapes de vulnerabilitat obtinguts pel Sistema d´Informació Geogràfica (GIS) en la zona per a aquests mateixos herbicides. Els pous analitzats es caracteritzen per tenir un nivell de vulnerabilitat diferent a l'establert mitjançant l'aplicació de models GIS. Els resultats obtinguts apunten a l'existència de factors addicionals al nivell de vulnerabilitat dels sòls. Aquests resultats es van comparar amb els obtinguts en diverses zones d'Itàlia sobre la vulnerabilitat dels aqüífers subterranis al glifosat (herbicida que d'acord amb els models de GIS no hauria de lixiviar). Tots dos estudis confirmen la importància de la integració entre les dades de la vigilància i el model per a subratllar els casos en els quals el comportament no s'ajusta al predit pel model i els problemes específics vinculats a males pràctiques agrícoles i a les especificitats territorials.