نبذة مختصرة : La presente Tesis describe el diseño y la evaluación de nuevas estrategias, tanto ópticas como electroquímicas, para la detección rápida de bacterias patógenas en seguridad alimentaria. En la misma, se evalúan diferentes plataformas electroquímicas, basadas principalmente en biocompósitos de grafito-epoxi así como en el acoplamiento de partículas magnéticas a compósitos de grafito-epoxi. Las partículas magnéticas utilizadas permitieron la inmovilización covalente del bioreceptor en su superficie, tales como partículas magnéticas modificadas con estreptavidina, anticuerpos o bacteriófagos, así como también la inmovilización electroestática del analito mediante las partículas magnéticas de sílice. De este modo, se estudiaron diversas interacciones de bioafinidad tales como biotina-avidina, anticuerpo-antígeno y bacteriófago-receptores de superficie bacterianos. En primer lugar, se evaluó un método rápido de cribado para la tuberculosis bovina en leche y productos lácteos basado en un genosensor electroquímico de ADN específico para M. bovis. En este estudio se evaluaron dos plataformas: i) biocompósitos grafito-epoxi de avidina (Av-GEB), y ii) magneto-electrodos basados en compósitos grafito-epoxi (m-GEC) acoplados a partículas magnéticas. Se determinaron muestras de leche provenientes de granjas y se compararon con el test de tuberculina, así como en un ensayo inter-laboratorio de PCR. A continuación se estudiaron diferentes estrategias bioanalíticas para la detección de bacterias patógenas utilizando Salmonella como modelo. La primera estrategia se basa en un doble bioreconocimiento de la bacteria, i.e. inmunológico y genético. Las bacterias fueron capturadas y pre-concentradas de muestras alimentarias mediante partículas magnéticas modificadas con el anticuerpo específico para Salmonella a través de la reacción inmunológica. Tras la separación inmunomagnética, las bacterias capturadas fueron lisadas y el ADN amplificado específicamente mediante PCR con cebadores doblemente marcados. Por último, el amplicon fue detectado mediante un magneto-genosensor electroquímico. La segunda estrategia se basó, por primera vez, en el uso de bacteriófagos como elemento de bioreconocimiento en la separación magnética de bacterias patógenas. Así, se exploró el potencial de los fagos tomando como modelo el fago P22 específico para Salmonella, el cual se inmovilizó de forma orientada sobre las partículas magnéticas. A continuación las bacterias fueron capturadas y pre-concentradas mediante las partículas modificadas a través de la interacción fago-huésped. Para confirmar la identidad de las bacterias se procedió a la amplificación del ADN mediante PCR de doble marcación y detección mediante un magneto-genosensor electroquímico. La tercera estrategia presentada para detección de Salmonella se basó en la detección de la célula entera mediante un doble reconocimiento inmunológico. Las bacterias fueron capturadas y pre-concentradas de muestras alimentarias mediante separación inmunomagnética. A continuación, la marcación enzimática se realizó mediante un segundo anticuerpo específico para Salmonella, llevándose a cabo de este modo la detección mediante un magneto-inmunosensor electroquímico. Aunque los límites de detección obtenidos fueron superiores, el tiempo de ensayo y la complejidad del procedimiento fueron reducidos considerablemente. Las características analíticas de esta estrategia fueron evaluadas no solo para detección electroquímica sino también óptica, desarrollando de este modo un magneto-inmunoensayo óptico como última estrategia presentada para detección de Salmonella. Finalmente, la última estrategia desarrollada en la Tesis se basó en la detección de los tres patógenos más frecuentes en seguridad alimentaria (Salmonella, Listeria y E. coli) mediante un magneto-genosensor electroquímico. Tras la extracción del genoma bacteriano se realizó la amplificación de este mediante PCR utilizando cebadores con tres marcas diferentes. Los amplicones marcados fueron inmovilizados en partículas magnéticas de sílice y posteriormente detectados electroquímicamente. Cabe destacar que biosensores basados en las estrategias presentadas en esta Tesis son herramientas ideales para ser utilizados en la detección rápida, económica y sensible del riesgo de contaminación de patógenos en una gran variedad de matrices.
نبذة مختصرة : This dissertation reports the design and evaluation of novel strategies, based on both optical and electrochemical detection, for the rapid detection of pathogenic bacteria in food safety applications. Different electrochemical platforms, based on the coupling of magnetic particles with magneto graphite-epoxy composite as well as graphite-epoxy biocomposite, were explored. Magnetic particles which allow covalent or electrostatic immobilisation were used, e.g. silica, streptavidin, antibody and phage-modified magnetic particles. Thus, several bioaffinity interactions such as biotin-avidin, antibody-antigen and bacteriophage-bacterial surface receptors were evaluated. Firstly, a rapid method for screening-out of bovine tuberculosis in milk and dairy products based on electrochemical genosensing of DNA specific of M. bovis is presented. In this study, two different platforms for electrochemical genosensing were evaluated: i) an avidin-biocomposite (Av-GEB), and ii) streptavidin-modified magnetic particles coupled with a magneto-electrode based on graphite-epoxy composite (m-GEC). The comparison with the tuberculin skin test and an inter-laboratory PCR assay was performed with raw milk samples collected from local dairy farm tanks. Moreover, different biosensing strategies for pathogenic bacteria were evaluated by using Salmonella as a model. The first approach relies on a double biorecognition of the bacteria, i.e. immunological and genetic biorecognition. The bacteria were captured and pre-concentrated from food samples with magnetic particles by the immunological reaction with the specific antibody against Salmonella. After the immunomagnetic separation, the captured bacteria were lysed, and further amplification of the genetic material by Polymerase Chain Reaction with a double-tagging set of primers was performed to confirm the identity of the bacteria. The double-tagged amplicon was then detected by electrochemical magneto- genosensing. The second strategy is based, for the first time, on the use of bacteriophages, as biorecognition element for the magnetic separation of pathogenic bacteria. The phage capabilities were explored by using the phage P22 towards Salmonella as a model which was immobilised in an oriented way on magnetic particles. The bacteria were then captured and pre-concentrated by the phage-modified magnetic particles throughout the phage-host interaction. To confirm the identity of the bacteria, further double-tagging PCR amplification of the captured bacteria DNA and electrochemical magneto-genosensing of the amplicon were performed. The third strategy for Salmonella detection relies on the detection of the whole bacteria by a double immunological recognition. The bacteria were captured from food samples and pre-concentrated by immunomagnetic separation. Then, the enzymatic labelling of the bacteria was also performed using a specific antibody against Salmonella, performing thus the electrochemical magneto-immunosensing. Although higher LODs were obtained, the assay time and complexity of the procedure were reduced considerably. The analytical features of the magneto-immunosensing of Salmonella were evaluated not only for electrochemical but also for optical detection, developing thus an optical magneto-immunoassay as the last strategy presented for Salmonella detection in this dissertation. Finally, the last strategy developed is based on the electrochemical magneto-genosensing of the three most common pathogenic bacteria in food safety (Salmonella, Listeria and E. coli). This approach was performed by the release of the bacteria genome followed by PCR in order to obtain the tagged amplicons by using three different coding tags. The tagged amplicons were then immobilised on silica magnetic particles. To confirm the identity of the three bacteria, the tagged amplicons were detected by electrochemical magneto-genosensing using three different electrochemical reporters. It is important to highlight that biosensing devices based on these strategies are ideal tools for being used as an alarm to rapidly detect the risk of contamination by pathogens in an inexpensive and sensitive manner and in a wide variety of matrixes.
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