Non-ribosomal peptide synthetase engineering focusing on the condensation domain and the condensation/adenylation domain interface

2022

Non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs) are modular biosynthetic megaenzymes producing many important natural products and refer to a specific set of peptides in bacteria’s and fungi’s secondary metabolism. With the actual purpose of providing advantages within their respective ecological niche, the bioactivity of the structurally highly diverse products ranges from, e.g., antibiotic (e.g., vancomycin) to immunosuppressive (e.g., cyclosporin A) to cytostatic (e.g., echinomycin or thiocoralin) activity. An NRPS module consists of at least three core domains that are essential for the incorporation of specific substrates with the 'multiple carrier thiotemplate mechanism' into a growing peptide chain: an adenylation (A) domain selects and activates a cognate amino acid; a thiolation (T) domain shuffles the activated amino acid and the growing peptide chain, which are attached at its post-translationally 4ʹ-phosphopantetheine (4'-PPant) group, between the active sites; a condensation (C) domain links the upstream and downstream substrates. NRPS synthesis is finished with the transfer of the assembled peptide to the C-terminal chain-terminating domain. Accordingly, the intermediate is either released by hydrolysis as a linear peptide chain or by an intramolecular nucleophilic attack as a cyclic peptide. The NRPS’s modular character seems to imply straightforward engineering to take advantage of their features but appears to be more challenging. Since the pioneering NRPS engineering approaches focused on the reprogramming and replacement of A domains, several working groups developed advanced methods to perform a complete replacement of subdomains or single or multiple catalytic domains. The first part of this work focusses parts of the publication with the title 'De novo design and engineering of non-ribosomal peptide synthetases', which follows up assembly line engineering with the development of a new guideline. Thereby, the pseudodimeric V-shaped structure of the C
Nicht-Ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind modular aufgebaute biosynthetische Megaenzyme, die Peptide mit hoher struktureller und bioaktiver Diversität produzieren. Dabei bilden sie eine spezifische Gruppe von Peptiden im Sekundärstoffwechsel von Bakterien und Pilzen. Mit dem eigentlichen Zweck, Vorteile innerhalb ihrer jeweiligen ökologischen Nische zu ermöglichen, erstreckt sich die Bioaktivität der vielfältigen Produkte von z.B. antibiotischer (z.B. Vancomycin) über immunsuppressiver (z.B. Cyclosporin A) bis hin zu zytostatischer (z.B. Echinomycin oder Thiocoralin) Aktivität. Nicht-ribosomale Peptide (NRPs) oder die von NRPs abgeleiteten Peptide stellen daher eine wichtige Klasse pharmazeutisch relevanter Wirkstoffe dar, die über die letzten Jahrzehnte in der klinischen Anwendung etabliert werden konnten. Die Synthese von nicht-ribosomalen Peptide ist in einer modularen fließbandähnlichen Logik organisiert, bei dem jedes Modul für den Einbau einer bestimmten Aminosäure verantwortlich ist. Damit ist die Synthese nicht von der mRNA sondern von der Aminosäurespezifität, Anzahl und Organisation der Module anhängig. Trotz determinierter Modulabfolge lassen sich NRPS nach ihrer biosynthetischen Logik in lineare NRPS (Typ A), iterative NRPS (Typ B) und nichtlineare NRPS (Typ C) einordnen. Gemeinsam ist allen jedoch, dass sie den Einbau spezifischer Substrate in eine wachsende Peptidkette durch den „multiple carrier thiotemplate mechanism“ katalysieren. Ein NRPS Modul besteht aus mindestens drei Kern-Domänen: Einer Adenylierungs (A) Domäne, die ein passendes Substrat erkennt und aktiviert; einer Thiolierungs (T) Domäne die aktivierten Aminosäuren bzw. die wachsende Peptidkette, die an ihrer posttranslationalen 4'-PPant-Gruppe gebunden ist, zwischen den aktiven Stellen hin und her befördert; und einer Kondensations (C) Domäne, die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Substrate verbindet und eine Kontrollfunktion der Substrat- und Stereoselektivität einnimmt. Im An

ddc:570; doctoralthesis; doc-type:doctoralThesis

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