Establishment of reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for the detection of newly described RNA viruses in reptiles : picornaviruses in tortoises, reptarenaviruses in snakes, and sunshinevirus in snakes

Universität Hohenheim Fakultät Agrarwissenschaften. Institut für Nutztierwissenschaften 2018

The purpose of this study was to establish conventional reverse-transcriptase PCRs for the detection of recently described RNA viruses in reptiles. The viruses studied included picornaviruses of tortoises (torchivirus or virus “X”), reptarenaviruses and sunviruses in snakes. Picornaviruses are detected frequently in tortoises of various species in Europe. Until recently, tortoise picornaviruses (previously designated as virus “X”) could only be detected by isolation in Terrapene heart (TH1) cells in which they cause cell lysis, and nothing was known about the relationships of various isolates to one another. Clinical signs that have been described in picornavirus infected tortoises include softening of the shell in juvenile tortoises, rhinitis, conjunctivitis, kidney failure, and sudden death, but these viruses have also been detected in clinically healthy animals. This group of picornaviruses is able to infect a wide range of species in the family Testudinidae and has been detected in tortoises in many different European countries. In this study, a conventional RT-PCR was developed and established for the detection and identification of picornaviruses in clinical samples. To test the reliability of this RT-PCR as a diagnostic method and the several primer sets which were designed for this purpose (Table 4.7), 37 picornaviruses isolated from swabs and tissue samples collected in Germany and Italy between 1997 and 2012 were screened. The primer pair FKei2 (CTACCATCAGGATGCAGTT) - RKei2 (AAGCCAATCCTGCAACACT) gave the highest number of positive results from the chosen isolates (70%). 308 nucleotide long sequences of the amplified products of 26 picornavirus isolates were obtained which represent a small part of the viral polyprotein gene. Alignment of the obtained sequences from the amplified products revealed a close genetic relationship among the detected tortoise picornavirus isolates confirmed by the high identity values between 79.2 – 100% (Table 11.3 in appendix).
Ziel der vorliegenden Arbeit war Etablierung von konventionellen Reverse-Transkriptase-PCRs für den Nachweis von den bisher bekanten RNA-Viren in Reptilien. Zu den untersuchten Viren gehörten Picornaviren in Schildkröten (Torchiviren oder virus "X"), Reptarenaviren und Sunviren in Schlangen. Picornaviren wurden bisher bei verschiedenen Schildkrötenspezies nachgewiesen im Europa am häufigsten werden sie bei Testudinidae gefunden. Bis vor kurzem, Picornaviren aus verschiedenen Proben von Landschildkröten wurde nur auf die Zelllinie Terrapene Heart cells (TH1) nachweisen und isoliert, dabei einen lytischen zytopathischen Effekt verursacht und nichts war bekannt über die Beziehung zwischen Vieren Isolaten. Zu den klinischen Zeichen gehören Panzererweichung bei Jungtieren, Rhinitis, Konjunktivitis, Nierenausfall, sowie plötzlichen Todesfällen, allerdings Picornaviren können gelegentlich auch bei scheinbaren gesunden Schildkröten nachweisen werden. In dieser Arbeit wurde eine konventionelle RT-PCR entwickelt und festgestellt für die Diagnose und Identifizierung von Piconaviren in klinischen Tierproben. 37 Picornaviren wurde isoliert vom Rachentupfer und von den verschiedenen Gewebeproben, diese wurden in Deutschland und Italien zwischen 1997 – 2012 gesammelt. Alle Isolate wurden abgeschirmt für den Zweck überprüfen die Zuverlässigkeit dieser RT-PCR als Diagnostische Methode und überprüfen die verschiedenen Primer-Sets, die zu diesem Zweck entworfen wurden (Table 4.7). Das Primer paar FKei2 (CTACCATCAGGATGCAGTT) - RKei2 (AAGCCAATCCTGCAACACT) hat die Mehrheit (70%) von der positiven Ergebnisse aus den ausgewählten Isolaten vorgelegt. Von 26 Picornaviren Isolaten Nukleotidsequenzen der amplifizierten Produkte wurde erhalten mit einer Länge von 308, und die einen kleinen Teil des viralen Polyprotein-Gens darstellen. Die Ausrichtung der erhaltenen Sequenzen aus den amplifizierten Produkten ergab eine enge genetische Beziehung zwischen den detektierten Schildkrötenpikornavirus

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