نبذة مختصرة : The present work wishes to contribute with information on two members of the primary active transporter group, which differ both in structure and function: Wilson Disease Protein which uses the energy released by ATP hydrolysis to transport copper across cell membranes, and Proteorhodopsin, which uses the energy of light to build up a proton gradient across the bacterial cell membrane, both heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. The surface detection experiments using HA-tagged WNDP confirm the proposed topology of WNDP. The HA-tag per se does not interfere with the function of WNDP, as shown for WNDP HA56 by ATP-dependent phosphorylation after expression in Sf9 cells. Sequence modifications within the WNDP HA56 template-construct reveal some interesting features: i) the N-terminal domain, which contains the 6 metal binding sites, is not necessary for plasma membrane targeting; ii) elevated surface expression of WNDP was observed when the carboxy terminus containing the tri-Leu motif is missing, which suggests that this motif might be involved in the retrieval of the protein from the plasma membrane; iii) the mutations TGE>AAA (proposed to lock the protein in the E1 conformation and lead to constitutive plasma membrane localisation) and D1027A (phosphorylation deficient) did not interfere with the surface localisation of the protein; iv) the mutations CPC>SPS (copper transport deficient) and H1069Q (phosphorylation deficient, most common mutation in Wilson Disease) reduced plasma membrane expression to less then 50%. Western blot analysis shows that the overall expression level of all constructs is similar to that of the reference construct WNDP HA56. These findings suggest that motifs involved in copper binding and catalytic activity do not interfere with plasma membrane targeting of WNDP in Xenopus oocytes. However, the H1069Q mutation could interfere with the distribution of WNDP protein within the cells. In the case of Proteorhodopsin, data presente
Die vorliegende Arbeit beinhaltet Experimente zum Studium zweier primär aktiver, in Membran lokalisierter Transportproteinen. Sie wurden heterolog in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert. Hierbei handelt es sich um eine Schwermetall-ATPase, das „Wilson Disease Protein“, und eine lichtgetriebene Protonenpumpe, „Proteorhodopsin“. Das „Wilson Disease Protein“ (WNDP) ist eine, aus 1465 Aminosäuren bestehende P1-Typ Cu+-ATPase, die wichtig ist, um während der Proteinsynthese im Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) Kupfer Ionen (Cu+) bereitzustellen, und im Falle einer Erhöhung des intrazellulärem Kupfer- Konzentrazion trägt, durch nicht ausreichend geklärten Mechanismen, zur Wiederherstellung des physiologischen Cu-Spiegels bei. Durch Mutationen bedingte Fehlfunktionen von WNDP führen zu der Erbkrankheit Morbus Wilson. Die vorliegende Arbeit versucht, die Xenopus-Oozyten – ein bekanntes System zum Studium von Transportproteinen der Plasmamembran – als ein alternatives Expressionssystem zu evaluiren. Die Experimente zeigen, dass das Wilson Disease Protein in Xenopus-Oozyten exprimiert werden kann. Es befindet sich in der Plasmamembran der Oozyten und kann durch Chemilumineszenz und Elektronenmikroskopie detektiert werden. Die Experimente zu Oberflächenexpression, bei denen mit HA-Epitopen markiertes WNDP verwendet wurde, bestätigen die für WNDP vorgeschlagene Topologie. Sequenzänderungen, die in das Konstrukt WNDP HA56 eingefügt wurden, offenbaren einige interessante Eigenschaften des Proteins: i) Die N-terminale Domäne, die 6 Metall-Bindestellen enthält, ist offensichtlich für die Zielsteurung in die Plasmamembran targeting nicht notwendig. ii) Bei fehlendem Carboxy-terminus – wodurch das triple-Leucin-Motiv deletiert wird – kommt es zu einer verstärkten Oberflächenexpression von WNDP, woraus sich Hinweise auf eine Beteiligung dieses Motives bei der Relokalisation des Proteins aus der Plasmamembran zum TGN ergeben. Ausserderm, die Resultate weisen darauf hin, dass die Motive, die
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