Pharmako-epigenetische Untersuchungen zur Therapieresistenz im Neuroblastom

Aberrante DNS-Methylierungen sind mit der Krebsentstehung und Entwicklung von Chemotherapie-Resistenzen, einer großen Hürde bei der Behandlung rezidivierender Neuroblastome (NB), assoziiert. In dieser Arbeit wurde in chemotherapieresistenten und –sensitiven Neuroblastomen nach Genen gesucht, die durch Unterschiede in ihrer epigenetischen Regulation und Expression an der Entwicklung einer Therapieresistenz beteiligt sein können. Dazu wurde in chemotherapie-resistent gezüchteten NB Zellen ein Microarray basiertes Screening (DMH-Analyse) unter Verwendung einer 14.000 CpG-Inseln umfassenden Bibliothek durchgeführt. In diesem präklinischen Modell wurde das Zinkfingerprotein-Gen ZFP37 identifiziert, welches in Doxorubicin-resistenten LAN1 und Kelly Zellen und in Cisplatin-resistenten Kelly Zellen im Vergleich zu sensitiven Zellen hypermethyliert vorlag. Expressionsanalysen bestätigten die transkriptionale Repression von ZFP37 in resistenten versus sensitiven Zellen. Die ZFP37-Proteinexpression nahm in sensitiven Zellen dosisabhängig unter Doxorubicin-Inkubation zu, während sie in DoxoR Zellen weiter abnahm, was einen Mechanismus zur Expressionsinhibierung in resistenten Zellen nahelegt. Demethylierung der Zellen durch Behandlung mit 5-Aza-2´-deoxycytidin stellte die ZFP37-Expression wieder her. Durch Bisulfit-Sequenzierung und Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) wurden leichte Differenzen zwischen der ZFP37 Methylierung in resistenten und sensitiven Zellen festgestellt. Die für die verminderte Expression verantwortliche Hypermethylierung liegt jedoch vermutlich außerhalb der analysierten Sequenzen. Quantitative Real-Time PCR Expressionsanalysen mit 68 primären Tumoren zeigten einen Zusammenhang zwischen einer verminderten ZFP37-Expression und metastasierten NB. In primären NB wurde durch Genexpressionschip-Analysen eine inverse Korrelation zwischen der Expression von ZFP37 und den resistenzassoziierten Genen MGMT und ABCC4 beobachtet. Die Inhibition der ZFP37-Expression in vitro durch shRNS-Transfektion ...