Utilización de una mutación activadora de glucoquinasa para la obtención de 'super-islotes' pancreáticos

Motivación: La glucokinasa (GK) de mamíferos, es una hexokinasas. Las mutaciones en esta proteína, se pueden clasificar dentro de dos grupos: i) inactivadoras, que conllevan a diabetes tipo MODY (maturity onset diabetes of the young) y ii) activadoras que producen una hipoglucemia neonatal severa, cuyo único tratamiento es la pancreatectomía subtotal. Una de esas mutaciones es la V91L, la cual es el objetivo de este trabajo. Los pacientes con esta mutación se caracterizan por islotes pancreáticos de mayor tamaño, con una mayor proliferación y apoptosis. Además, de una mayor sensibilidad a la glucosa. El objetivo de este trabajo es introducir la mutación V91L en islotes pancreáticos con el fin de conseguir islotes que proliferan y tienen una mejor respuesta secretora de insulina. Estos islotes se podrían utilizar posteriormente en la terapia celular de la diabetes. Métodos: Se ha utilizado un sistema de expresión de tres plásmidos (eGFP, GCK, V91L) para generar tres vectores recombinantes de lentivirus, que contienen un gen marcador GFP. Pare ello se insertó en el vector viral el gen que codifica para la isoforma pancreática humana de la glucoquinasa, en sus dos variantes, la glucoquinasa normal y la mutada (V91L). Posteriormente, se procedió a transfectar células en cultivo (A293T) con dichos plásmidos cuya transección se comprobó por inmunofluorescencia y wester blotting. Sucesivamente, se procedió a la formación de unidades víricas, y se realizó la titulación de los mismos por citometría de flujo. A continuación, se procede a infectar celulas con los virus obtenidos y posteriormente infectar islotes pancráticos de ratón.Resultados: Se ha conseguido una óptima transefección de los respectivos plásmidos, así como, una óptima titulación vírica tras la infección de células A293T (entre 50-90%).Conclusiones: La introducción de dicha mutación espontánea (V91L), mediante el uso de vectores virales (lentivirus), en islotes pancreáticos tiene como fin aumentar la proliferación de las células β y la secreción de ...