PROKR1 delivery by cell-derived vesicles recovers the myogenic potency of C2C12Prokr1-/- cells ; 세포 유래 소포체를 이용한 PROKR1 전달을 통한 C2C12Prokr1-/-세포의 근분화능 회복에 관한 연구

학위논문 (석사) -- 서울대학교 대학원 : 국제농업기술대학원 국제농업기술학과, 2020. 8. 박중훈. ; 엑소좀은 세포로부터 분비된 나노 소포체이며, 이는 세포 간 신호전달에서 중요한 역할을 담당하고 있다. 엑소좀은 서로 다른 세포 사이에 단백질, 지질, mRNA, miRNA 및 DNA를 포함한 생체 분자를 전달하는 역할을 한다. 엑소좀은 생체 적합성, 안정성 및 낮은 면역원성을 통해 임상적 활용 가능성이 활발히 연구되고 있다. 그러나, 낮은 제작 수율, 이종성, 노동 집약적 제조 절차 및 치료 적 로딩은 엑소좀의 임상 적용에 제약 요소로 제기되고 있다. 세포 유래 소포체는 천연 엑소좀에 비해 높은 생산성을 나타내며 생화학적 호환성으로 인해 엑소좀의 대안으로 간주되고 있으며, 이는 세포 유래 소포체의 임상 적용 가능성을 높여준다. 본 연구에서는 세포 유래 소포체를 통한 표적 막단백질 전달을 통해 근육 분화능이 상실된 세포의 근분화능 회복과 포도당 대사능의 회복 여부를 평가하였다. 이를 위한 개념 증명 연구로, 세포 유래 소포체를 이용하여 표적 세포로의 녹색 형광 단백질 (GFP)의 전달을 평가하였다. GFP를 도입한 인간 배야 신장 세포(GFPTg HEK293T)를 미세 압출하고, 회수된 세포 유래 소포체를 OptiPrep 밀도구배 초고속 원심분리를 통해 정제하여 GFP가 함유된 고순도의 세포 유래 소포체(GFPTg CDVs)를 제작하였다. 107개의 세포로부터 약 100 μg의 GFPTg CDVs가 제작되었으며, 세포 유래 소포체의 평균 직경은 약 173.1 nm로 기존에 보고된 천연 엑소좀의 크기와 유사 하였다. 단백질 분석을 통해 GFPTg CDVs는 CD9 및 CD81과 같은 엑소좀 마커 단백질을 발현하고 있음을 관찰하였다. 또한, GFP가 없는 일반 HEK293T 세포에 GFPTg CDVs처리 후 30분부터 세포에서 GFP 단백질 및 mRNA가 성공적으로 검출되었고, GFP의 발현은 해당 세포에서 최대 48 시간 동안 유지되었다. 이러한 결과에 기초하여, 세포 유래 소포체를 이용한 PROKR1의 전달이 근분화능을 상실한 C2C12Prokr1-/-세포의 분화 능력을 회복시킬 수 있는지를 확인하기 위해 약리 연구를 수행하였다. Prokr1은 골격근의 대사 항상성에 중요한 유전자로, C2C12Prokr1-/- 근모세포는 근관으로 분화 될 수 없었다. PROKR1을 과발현시킨 HEK293T 세포로부터 상술한 과정과 동일하게 제작된 PROKR1Tg CDVs는 평균 직경 161.7 nm로 관찰되었고, CD9 및 CD81을 포함한 표준 엑소좀 마커 단백질을 발현하였다. 또한, PROKR1Tg CDVs는 PROKR1 단백질을 함유하는 것을 확인하였고, PROKR1 단백질은 Prokr1이 결손된 C2C12Prokr1-/- 근모세포에 성공적으로 전달되는 것을 관찰하였다. 세포 처리를 위한 PROKR1Tg CDVs의 농도는 MTT 분석을 통해 확인하였고, 세포 독성이 없는 PROKR1Tg CDVs의 최적 농도는 25 μg/mL 이하로 결정되었다. 근모세포 분화 후 출현하는 근아세포에서 PROKR1Tg CDVs에 의한 세포사멸 저해 효과는 유세포 분석을 통해 확인하였고, PROKR1Tg CDVs는 C2C12Prokr1-/- 유래 근아세포의 사멸을 8.4 % 수준에서 유의적으로 감소시키는 것을 밝혀냈다. PROKR1Tg CDVs는 C2C12Prokr1-/- 근아세포로부터 정상적인 C2C12 세포와 유사한 근관세포를 형성하였고, 해당 근관세포는 Myh7, Mb 및 Myod 등 근관세포 마커 유전자의 발현 향상 및 Pax3, Pax7 및 Myod등 근모 및 근아세포 마커 유전자의 발현 감소를 나타내었다. 또한, PROKR1Tg CDVs로 유도된 C2C12Prokr1-/- 유래 근관세포는 정상적인 C2C12 세포 유래 근관세포와 유사한 수준의 인슐린 자극에 의한 포도당 흡수 반응을 나타내었다. 이러한 결과는 PROKR1Tg CDVs가 PROKR1단백질을 C2C12Prokr1-/- 근모세포로 효율적으로 전달하고 결손된 근분화능을 회복시킬 수 있음을 의미한다. 결론적으로, 이러한 결과는 PROKR1Tg CDVs를 ...