Μελέτη της ειδικότητας πρόσδεσης νανοαντισωμάτων στον επίτοπο-στόχο τους ; Specificity studies of nanoantibodies binding their target-epitope

Τα νανοαντισώματα (nanoantibodies, Nbs) είναι μία ειδική κατηγορία μικρών, γενετικά τροποποιημένων μορίων-αντισωμάτων που προέρχονται από ζώα της οικογένειας των καμηλίδων ή των χονδροϊχθύων και παρουσιάζουν σπουδαίες φυσικοχημικές ιδιότητες καθώς και πληθώρα εφαρμογών, στοχεύοντας εξωκυττάριους αλλά και ενδοκυττάριους επιτόπους. Παράλληλα, ένα σημαντικό μόριο-στόχος στην βιοϊατρική έρευνα αποτελεί η Lck (lymphocyte-specific protein-tyrosine kinase), μία πρωτεϊνική κινάση τυροσίνης της οικογένειας των Src κινασών που αποτελεί απαραίτητο μόριο για την ενδοκυτταρική σηματοδότηση και την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Η αναστολή της δράσης της αποτελεί πεδίο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας, καθώς επιτρέπει τη χειραγώγηση των Τ κυττάρων και έτσι έχει σημασία για πολλές παθολογικές καταστάσεις, μεταμοσχεύσεις οργάνων και θεραπείες βασιζόμενες σε Τ κύτταρα, όπου εμφανίζεται ανώμαλος αριθμός Τ κυττάρων ή υπερδιέγερσή τους. Όμως, η υψηλή της ομολογία με τις υπόλοιπες Src κινάσες στο καταλυτικό κέντρο τους έχει δημιουργήσει μεγάλες προκλήσεις για την ειδική παρεμπόδισή της, με τους γενικούς αναστολείς των Src κινασών να παρουσιάζουν ανεπιθύμητες τοξικές αντιδράσεις. H παρούσα διπλωματική εργασία στοχεύει στην ανάπτυξη ενδοκυτταρικά παραγόμενων Nbs που προσδένονται ειδικά σε έναν μη συντηρημένο επίτοπο της Lck, σημαντικό για την τοποθέτησή της στην πλασματική μεμβράνη και τη δράση της στα υποστρώματά της. Μέσω μεθόδων κλωνοποίησης αναπτύχθηκαν Nbs με τροποποιήσεις κατάλληλες για τη στρατολόγησή τους στην πλασματική μεμβράνη, με στόχο το συνεντοπισμό τους με την Lck. Αρχικά, με πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης (co-immunoprecipitation, co-IP) σε ένα εξωγενές σύστημα επαγόμενης έκφρασης Nb και Lck σε HEK293T κύτταρα, πραγματοποιήθηκε διαλογή των πιο αποτελεσματικών Nbs όσον αφορά την πρόσδεση στην Lck. Στη συνέχεια, μετά από διαμόλυνση Τ κυττάρων με λεντιϊούς που φέρουν τα γονίδια των Nbs και με co-IP πειράματα, αναδείχθηκαν τα Nbs που ήταν ικανά να προσδεθούν στην ενδογενή μορφή της Lck σε Τ κυτταρικό περιβάλλον και αυτό ...