Recombination-independent genomic editing and chromosomal site-focused diversification of Gram-negative bacteria

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de Lectura: 24-02-2022 ; A pesar del creciente interés en la edición de genomas microbianos para investigaciones fundamentales y aplicaciones biotecnológicas, todavía hay una escasez de herramientas genéticas para diseñar eficazmente bacterias Gram negativas no-modelo. En este contexto, el objetivo general de esta Tesis ha sido el aumentar las metodologías para la introducción de diversos tipos de mutaciones en diferentes especies bacterianas y fondos genéticos con múltiples propósitos. Con este fin, hemos adaptado la tecnología targetron basada en el intrón del grupo II de Lactococcus lactis, Ll.LtrB, para ser usada en combinación con CRISPR/Cas9 como forma de contraselección. Los intrones del grupo II son un tipo de retroelementos que pueden insertarse en regiones específicas de moléculas de ADN. Sus dianas pueden modificarse de forma que estos intrones pueden ser alterados para reconocer e insertarse en regiones deseadas del genoma, normalmente, con baja frecuencia. Gracias a la contraselección basada en CRISPR/Cas9, la eficiencia para identificar inserciones de Ll.LtrB en Escherichia coli y Pseudomonas putida se incrementó significativamente. Asimismo, pudimos ilustrar la posibilidad de usar esta combinación para mejorar la eficiencia del transporte de fragmentos insertados dentro de Ll.LtrB hacia el genoma de bacterias Gram negativas. Incluso si el límite de tamaño de los fragmentos a transportar fue moderado, también hemos descrito una aplicación útil del sistema para la integración de secuencias cortas que puedan funcionar como identificadores únicos o códigos de barra genéticos en diferentes organismos biológicos. Ya que una de las principales ventajas de los intrones del grupo II es tener un amplio rango de huéspedes, sostenemos que este uso puede ser de gran importancia en la implementación estándar de códigos de barras genéticos para la identificación de chasis relevantes en ...