Priprava celičnih modelov s stabilnim izražanjem proteinov z dipeptidnimi ponovitvami in ovrednotenje njihove vloge ; Preparation of cell models with stable expression of dipeptide repeat proteins (DPR) and evaluation of their role

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD) sta nevrodegenerativni bolezni, za kateri je značilno postopno slabšanje simptomov, ki neizogibno vodijo v smrt. Razlog za razvoj so lahko mutacije v več potencialnih genih. Kot enega izmed ključnih genov za razvoj ALS/FTD se smatra C9orf72. Mutacija se pojavi znotraj prvega introna, v katerem se nahajajo heksanukleotidne ponovitve GGGGCC. V normalnih pogojih jih je manj kot 30, ob mutaciji pa se število lahko poveča tudi na več tisoč. Ena glavnih hipotez, ki ponuja razlago za patološke vplive podaljšanih ponovitev v genu C9orf72, je akumulacija toksičnih agregatov proteinov z dipeptidnimi ponovitvami (DPR). Poznamo pet različnih proteinov DPR: poli(GA), poli(GR), poli(PA), poli(PR) in poli(GP). Nastanejo pri posebni obliki translacije, ki poteka neodvisno od začetnega kodona AUG. Pripravili smo pet celičnih linij, ki stabilno izražajo proteine DPR s 125 ponovitvami. Iz vnaprej pripravljenih plazmidnih vektorjev smo z restrikcijo izrezali zapise za proteine DPR in jih preklonirali v ekspresijski plazmidni vektor pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop. Želeli smo, da se proteini DPR izražajo skupaj s fluorescenčnim markerjem mScarlet. Ker vsi proteini DPR niso bili v enakem bralnem okvirju kot marker, smo bralni okvir osnovnega ekspresijskega vektorja premaknili za enega oz. dva nukleotida. Z dobljenimi konstrukti smo transficirali Flp-in celično linijo HEK293T. Flp-in sistem nam omogoča integracijo zapisov za proteine DPR v genom celic preko FRT mest, ki se nahajata na osnovnem plazmidu in v genomu celic. Po transfekciji in selekciji celic smo posamezne kolonije pripravili za mikroskopiranje in s fluorescenčno mikroskopijo preverili uspešnost izražanja proteinov DPR. S pomočjo fluorescenčnega markerja mScarlet smo dokazali izražanje proteinov DPR v celici. Ker smo pred mikroskopiranjem dodali tudi barvilo DAPI, smo lahko opazovali tudi lokalizacijo proteinov v celici. ; Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD) are ...