Arsenito oxidase bacteriana: caracterização a nível molecular

O arsénio encontra-se amplamente distribuído no meio ambiente, decorrente de processos naturais e antropogénicos. É geralmente encontrado nas formas de arsenito [As(III)] e arsenato [As(V)], altamente tóxicas. A arsenito oxidase (Aio) é uma enzima metabólica responsável pela oxidação de arsenito a arsenato. A estrutura cristalográfica da Aio do oxidante de arsenito Alphaproteobacterium Rhizobium sp. NT-26 foi previamente determinada a 2,7 Å de resolução. O principal objetivo deste trabalho é contribuir para a clarificação do mecanismo de reação da enzima através da caracterização estrutural da Aio nativa de NT-26 ligada a análogos do substrato, bem como vários mutantes da enzima, recorrendo à cristalografia de raios-X e ensaios cinéticos com base em espetroscopia de UV/Vísivel. Na presente dissertação são descritos os vários passos executados desde a mutagénese dirigida, expressão e purificação, cristalização, resolução e análise da estrutura e cinética enzimática, da proteína nativa e mutantes em estudo. Usando polietilenoglicol (PEG), como agente precipitante, foi possível obter cristais da proteína nativa e dos mutantes AioA Q726G e AioB F108A, permitindo a determinação das suas estruturas tridimensionais a 1,89; 2,18 e 2,20 Å de resolução, respetivamente. Os estudos com AioAB nativa na presença de antimonito indicam a ligação deste ao centro ativo da enzima, a cerca de 1,7 Å do ligando hidroxilo do molibdénio. Estes resultados sugerem que a ligação do substrato fisiológico, arsenito, será feita de forma semelhante, apesar de, na estrutura obtida, não se ter verificado a presença de um sexto ligando do molibdénio, como expectável de acordo com o mecanismo proposto na literatura, provavelmente devido a danos causados pela radiação. As estruturas cristalográficas dos mutantes AioA Q726G e AioB F108A mostram a presença dos resíduos mutados e a ausência de alterações globais na estrutura da proteína. Os ensaios cinéticos realizados mostram a diminuição de atividade no mutante AioA Q726G e o aumento de atividade ...