Desarrollo de partículas semejantes a virus (VLPs) basadas en al proteína VP6 de rotavirus como sistema de presentación de antígenos heterólogos ; Development of virus like particles (VLPs) based on VP6 protein of rotavirus as presentation system for heterologous epitopes

En este trabajo de tesis se ha ensayado la presentación de secuencias aminoacídicas heterólogas en la superficie de partículas semejantes a virus derivadas de la proteína VP6 de rotavirus para usos biotecnológicos. Para esto, se seleccionaron nueve sitios de inserción en la proteína VP6, que corresponden a las posiciones aminoacídicas 1,14, 101, 146, 171, 235, 301/308, 358, y 382 mediante algoritmos que predicen hidrofilicidad y antigenicidad, así como a partir de datos cristalográficos. A través de mutagénesis dirigida por PCR se insertó un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción XbaI en la secuencia de VP6 que permitió el clonado posterior de un epitope de 14 aminoácidos derivado del paramixovirus SV5, originando así las distintas versiones VP6-V5. De las distintas quimeras expresadas en células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes se determinaron los niveles de expresión alcanzados, su capacidad de trimerización, su capacidad de multimerización, sus propiedades antigénicas, su interacción con la proteína VP2 y su inmunogenicidad en animales de laboratorio. La inserción del epitope V5 en las posiciones 171, 235 y 301/8 impidió la formación de trímeros, mientras que la inserción de la secuencia heteróloga en las posiciones 358 y 382 afectó seriamente la capacidad de multimerizar, lo que no pudo ser revertido por la coexpresión de la proteína VP2, que estabiliza las estructuras multiméricas. Los resultados obtenidos aportan datos que ayudan a caracterizar con mayor precisión los dominios de trimerización y de multimerización de la proteína VP6, acotando el dominio de trimerización a los aminoácidos 171 y 328 y el de multimerización, a los aminoácidos 315 a 397. Por otro lado, la versión VP6/V514 no fue reconocida por distintos sueros policlonales anti-VP6, mientras que sí lo fue por un anticuerpo monoclonal anti-V5, indicando que mediante la inserción de una secuencia en esta posición se interrumpe el sitio antigénico lineal inmunodominante de la proteína VP6. La caracterización ...