Descripción de un nuevo tipo de vesícula de membrana externa en bacterias gramnegativas: implicaciones en el contenido de DNA y RNA

En la presente Tesis Doctoral se presenta la descripción y caracterización de un nuevo tipo de vesícula de membrana externa (MV) en bacterias gramnegativas, hallada tanto en cepas ambientales como en cepas patógenas. Para la caracterización de estas nuevas MVs se han utilizado técnicas de Criomicroscopía (Cryo-EM) y Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) de cortes ultrafinos de muestras preparadas mediante criofijación y criosubstitución (HPF-FS). La descripción del nuevo tipo de MVs ha aportado un nuevo modelo de vesiculación que sucede a través de la protuberancia conjunta de la membrana externa e interna, incorporando contenido del citoplasma. Éstas nuevas vesículas han sido nombradas como Vesículas de Membrana Externa e Interna (Outer-inner membrane vesicle, O-IMV). El inmunomarcaje de cortes ultrafinos de vesículas con un anticuerpo específico contra DNA, ha permitido confirmar que el DNA detectado contenido en muestras de MVs, es exportado en el interior de las nuevas O-IMVs. Las técnicas de TEM de cortes ultrafinos después de HPF-FS y Cryo-EM han sido esenciales para caracterizar el nuevo tipo de MVs. Asimismo, también han sido útiles para la caracterización de una cepa mutante hipervesiculante por delección de un componente estructural de la envuelta bacteriana, demostrando que los incrementos de MVs detectados como proteína o LPS, son causados por la presencia de artefactos vesiculares cuya funcionalidad se encuentra alterada respecto a las vesículas de la cepa salvaje. La descripción de las O-IMV ha permitido explicar cómo contenido del citoplasma es incorporado en vesículas. Este descubrimiento ha abierto la puerta a estudiar el contenido de RNA asociado a MVs de Pseudomonas aeruginosa PAO1. Se ha demostrando que el RNA en vesículas presenta unos tamaños comprendidos entre 40 ̶ 80 nucleótidos y contienen una proporción mucho menor de RNA ribosomal en comparación con la célula. La transcriptómica realizada comparando el contenido de RNA de muestras de MVs y células, ha confirmado que las MVs ...