Unapređenje metode za obogaćivanje i analizu N-glikozilacije membranskih proteina ; Improvement of methods for enrichment and analysis of N-glycosylation of membrane proteins

Analiza glikanskog dijela membranskih glikoproteina postala je važan analitički izazov zbog njihove izuzetne važnosti u međustaničnom prepoznavanju te interakcijama pojedinih molekula s receptorima na staničnoj površini. Brojni pokušaji izolacije membranskih glikoproteina naišli su na niz prepreka s obzirom na nedovoljnu ponovljivost metoda ili pak onečišćenje citosolnim glikoproteinima. Stoga je cilj ovog rada bio potvrditi učinkovitost i ponovljivost metode izolacije membranskih proteina s Triton X-114 i pročišćavanja organskim otapalima u svrhu analize njihove N-glikozilacije. Sama analiza N-glikana provedena je HILIC-UPLC kromatografijom. Korištene su stanice iz THP stanične linije, ali je ponovljivost potvrđena i na stanicama ljudskog mozga, leukocitima i lizosomima. U metodama za pročišćavanje izoliranih membranskih proteina korištena su različita organska otapala pomoću kojih je dobiven precipitat proteina. Organska otapala koja su upotrijebljena bila su aceton, kombinacija aceton/metanol i kloroform/metanol, gdje se posljednja kombinacija pokazala najučinkovitijom, iako sve tri metode daju kromatograme jednakog glikanskog profila. Također je pokazano da početna količina stanica utječe na intenzitet kromatografskih vršaka. Radi potvrde prisutnosti glikanskih struktura u dobivenim uzorcima, sakupljeni su pojedini kromatografski vršci koji su sekvencirani razgradnjom kombinacijom egzoglikozidaza koje otkidaju pojedine monosaharide s nereduktivnih krajeva glikana, a pokazuju određeni stupanj specifičnosti prema kidanju pojedinih veza. Na taj način uspješno su dokazane i identificirane pojedine glikanske strukture. Važnost ove studije je u napretku izolacije membranskih proteina čime je omogućen bolji uvid u njihovu N-glikozilaciju koja je, osim u dijagnostici i prognostici bolesti, danas važna i biofarmaceutskoj industriji zbog toga što glikozilacija ima učinak na fizikalno-kemijska svojstva proteina što se odražava na njihovu učinkovitost i sigurnost. ; Analysis of glycan part of membrane glycoproteins has ...