Enhancing the protein engineering toolbox: In vivo recombination in E. coli for multi-site-directed mutagenesis

Dissertação de mestrado em Genética Molecular ; A mutagénese é uma ferramenta inestimável na engenharia de proteínas, permitindo o melhoramento de proteínas via alterações na sequência de codificação das mesmas. De todos os métodos para a remoção, adição, ou substituição de nucleotídeos, a mutagénese baseada em PCR destaca-se como uma das abordagens mais simples e económicas, introduzindo alterações via primers não totalmente complementares ao modelo de replicação. Este tipo de mutagénese dirigida leva à criação de fragmentos mutantes que devem ser montados num plasmídeo viável antes da transformação do hospedeiro. É importante realçar que este passo, ou seja, a ligação de fragmentos, constitui a etapa mais cara do processo de mutagénese, sendo tradicionalmente feita com o uso de kits, usando uma mistura de enzimas proprietária para realizar uma ligação in vitro. Esta etapa é não só demorada, mas também, interessantemente, desnecessária, pois o hospedeiro comum, Escherichia coli, possui a maquinaria necessária para a montagem in vivo de fragmentos mutantes. No presente trabalho, um protocolo de mutagénese multi-sítio-dirigida simples e de baixo custo que faz uso deste mecanismo endógeno, sendo composto por apenas três etapas, nomeadamente, PCR, digestão DpnI, e transformação, foi desenvolvido e otimizado. Todas as etapas do protocolo de mutagénese foram investigadas e otimizadas para a introdução de três mutações na sequência de codificação da xilanase adaptada ao frio, pXyl. Ao longo do trabalho, 384 construções mutantes foram preparadas para determinar a quantidade ótima de modelo de PCR, o comprimento ideal dos primers mutagénicos, e a proporção mais eficaz dos diferentes fragmentos de PCR. Destas, 130 construções foram preparadas usando os nossos parâmetros ideais de 0,1 fmol de modelo de PCR total, primers de 52 nt e uma proporção mínima de fragmentos grandes a pequenos de 1:20:20, gerando plasmídeos contendo as três mutações desejadas com uma eficiência de 96 %. Além disso, o processo de remoção do modelo ...