Method optimization of miRNA-Seq experiments and biomarker identification for type 2 diabetes from plasma and saliva ; Methodenoptimierung von miRNA-Seq Experimenten und Identifizierung von Biomarkern für Diabetes Typ 2 aus Plasma und Speichel

MicroRNAs (miRNAs) sind ~22 Nucleotid (nt) lange endogene nichtkodierende RNAs, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Genexpression spielen. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass miRNAs als Biomarker verwendet werden können, da sie bei verschiedenen Erkrankungen, einschließlich Diabetes Typ 2 (T2D), eine differentielle Expression zeigen und aus Biofluiden wie beispeilsweise Blut, Speichel, Urin oder Muttermilch identifiziert werden können. Next Generation Sequencing (NGS) ist derzeit die Standardtechnologie für die Analyse von miRNAs. Ein entscheidender Schritt ist die Erstellung von Sequenzierungsbibliotheken, von denen jedoch berichtet wird, dass sie die Daten erheblich verzerren. Sequenzierungsbibliotheken-Kits werden stätig verbessert, um den Adapterligations- und PCR-Bias zu reduzieren. Obwohl die aktuellen miRNA-Bibliotheken bereits sehr geringe Input-Mengen erlauben, was bei der Isolierung von miRNA aus Biofluiden bedeutend ist, zeigen Studien, dass es noch immer Diskrepanzen zwischen den erhaltenen Ergebnissen verschiedener Kits gibt. Die Evaluierung verschiedener Sequenzierungsbibliotheken ist daher ein essentieller Schritt. In der vorliegenden Studie haben wir eine systematische Evaluierung von 4 verschiedenen Kits (QIASeq, RealSeq, NEBNext und Lexogen) durchgeführt. Einerseits wurde eine universelle Referenz verwendet, welche äquimolare Mengen von 564 menschlichen miRNAs enthielt. Andererseits wurden miRNAs aus zellfreien (cf) und extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Plasma und Speichel von gesunden Probanden isoliert um ein Verständnis der gesunden miRNA-Expression zu etablieren und die Unterschiede der Sequenzierungsbibliotheken mit den verschiedenen Probenmatrizen zu bewerten. Die Ergebnisse des Vergleichs zeigten, dass keines der verwendeten Kits die Gesamtmenge der miRNAs in der universellen Referenz nachweisen konnte. Jedoch fanden wir, dass die mit QIASeq erhaltenen Ergebnisse die Eigenschaften einer äquimolaren Probe am meisten widerspiegelten. Der Vergleich der verschiedenen ...