Producción de antígenos y anticuerpos de interés veterinario en plantas transplastómicas de tabaco ; Production of antigens and antibodies of veterinary interest in tobacco transplastomic plants

En esta Tesis Doctoral, se evaluó la factibilidad de utilizar plantas transplastómicas de tabaco (Nicotiana tabacum) para la producción de proteínas de interés en medicina veterinaria: dos antígenos virales y un anticuerpo de camélido de cadena simple (VHH). La primera proteína producida en este sistema consistió en una fusión entre un epítope inmunogénico de la proteina VP1 del virus de la fiebre aftosa y la enzima β-glucuronidasa (VP-βGUS). Se generaron plantas transplastómicas, las cuales fueron caracterizadas a nivel molecular. La proteína heteróloga se acumuló de un modo importante en los cloroplastos de las plantas transformadas: hasta el 51% de las proteínas solubles totales (PST) (8 mg/g de tejido fresco [TF]), conservando su actividad enzimática e inmunogenicidad. Los niveles de expresión observados resultaron claramente mayores a los obtenidos previamente en plantas transgénicas nucleares utilizando la misma construcción. A pesar de estos altos niveles de expresión, el fenotipo de las plantas transplastómicas resultó ser indistinguible del de las plantas wild-type. Esta prueba de concepto con resultados alentadores nos permitió avanzar en la producción de otras moléculas mediante este sistema. El segundo antígeno expresado fue VP8*, una proteína no glicosilada de la cápside de rotavirus bovino (RVB). Se utilizó una versión del vector que permite la acumulación de VP8* en el estroma y se generaron dos construcciones adicionales, una para expresarla como una fusión a la β-glucuronidasa (GUS-E-VP8*), y otra para dirigirla al lúmen de los tilacoides (str- VP8*). VP8* se acumuló como agregados insolubles en el estroma de los cloroplastos y pudo ser solubilizada parcialmente por sonicación. Se obtuvieron extractos de VP8* utilizando la fracción soluble, donde VP8* representaba el 4% de las PST (250 μg/g TF). Al extraerse VP8* a partir de la fracción insoluble sin incluir el paso de sonicación, fue posible enriquecer la preparación en la proteína recombinante, eliminar la nicotina, y mejorar el rendimiento al ...