ανάλυση μεταλλαγμένων στελεχών ποντικού που φέρουν τη μετάλλαξη icj στον LBR

Περιέχει εικόνες Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζεται στη μελέτη ποντικών οι οποίοι φέρουν, σε ετερόζυγη ή ομόζυγη μορφή, μία μετάλλαξη στον υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR). Οι πειραματικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιήθηκαν κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες: α) μορφολογική ανάλυση διαφόρων ιστών και κυττάρων, β) βιοχημική ανάλυση πυρηνικών πρωτεϊνών και γ) ανάλυση του προτύπου έκφρασης σε επίπεδο γονιδιώματος. Αρχικά, μελετήθηκαν οι ακόλουθοι ιστοί σε τομές παραφίνης: δέρμα, σπλήνας, λεπτό έντερο, παχύ έντερο, στόμαχος, ήπαρ, νεφροί, εγκέφαλος, καρδιά και πνεύμονες. Ταυτόχρονα, πραγματοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικές χρώσεις σε τομές παραφίνης, κρυο-τομές, ή επιχρίσματα (απομονωμένα σπληνοκύτταρα) χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναγνωρίζουν τις πυρηνικές λαμίνες, τον LBR, ή τις κερατίνες 8 και 19. Τέλος, μελετήθηκε η ικανότητα των Τ-λεμφοκυττάρων να μεταβαίνουν από τη φάση ηρεμίας (G0) σε φάση κυτταρικού πολλαπλασιασμού, μετά από ειδική επαγωγή με PHA. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι η αρχιτεκτονική των περισσότερων ιστών και η κατανομή των πρωτεϊνών που εξετάστηκαν δεν έχουν επηρεαστεί από τη μετάλλαξη στον LBR. Παρόλα ταύτα, από τη μορφολογική μελέτη προέκυψαν ενδείξεις ότι η αλωπεκία που παρατηρείται στα ομόζυγα ζώα οφείλεται σε εκλεκτική υπερπλασία της κεράτινης στοιβάδας της επιδερμίδας, ενώ η καχεξία που τελικά οδηγεί στον θάνατο μπορεί να συσχετίζεται με βλάβες του εντερικού επιθηλίου. Αυτή η υπόθεση βασίζεται στο γεγονός ότι το επιθήλιο του λεπτού εντέρου στα ομόζυγα ποντίκια χαρακτηρίζεται από την παρουσία συσσωματωμάτων χρωματίνης στον πυρηνικό φάκελο που εμφανίζουν έναν ενδιαφέροντα «μωσαϊκό» φαινότυπο. Η μορφολογική ανάλυση που πραγματοποιήσαμε συμπληρώθηκε με βιοχημική ανάλυση των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων στις ιστόνες Η3 και Η2Α με φασματοσκοπίας μάζας. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα συγκατακρήμνισης χρωματίνης χρησιμοποιώντας ως «δόλωμα» τις τρεις ισομορφές της ετεροχρωματινικής πρωτεΐνης HP1 και τον LBR. Τα παραπάνω πειράματα δεν αποκάλυψαν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στα αγρίου τύπου και τα μεταλλαγμένα ζώα. Τα παραπάνω δεδομένα, σε συνδυασμό με τον καχεκτικό φαινότυπο των ομόζυγων ζώων, έκαναν απαραίτητη τη χρήση της τεχνολογίας μικροσυστοιχιών DNA, ώστε να εξεταστεί η αλλαγή στο πρότυπο έκφρασης των γονιδίων που εκφράζονται στο λεπτό έντερο. Η ανάλυση αυτού του τύπου αποκάλυψε 149 γονίδια-στόχους των οποίων η μεταγραφική δράση είναι σημαντικά διαφορετική στα ομόζυγα ζώα. Πολλά από αυτά τα γονίδια αντιστοιχούν σε μεταγραφικούς παράγοντες, ενώ άλλα σχετίζονται (άμεσα ή έμμεσα) με την πρόσληψη και απορρόφηση θρεπτικών υλών. Τα γονίδια Smad3 και Banf1 παρουσίασαν αύξηση των επιπέδων του RNA τους και αυτό επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ποσοτικής PCR. Με τον ίδιο τρόπο μελετήθηκαν τα επίπεδα μεταγραφής των γονιδίων Areg, Reg3b/Pap, Vimentin και I-FABP2. Από τη μελέτη μας συμπεραίνεται ότι ο LBR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο μεταγραφικό έλεγχο συγκεκριμένων γονιδίων, άποψη που συμφωνεί με αποτελέσματα που έχουν δημοσιευθεί στην πρόσφατη βιβλιογραφία. Τhis work focuses on the study of mice carring a heterozygous and homozygous mutation in the lamin B receptor (LBR). The experimental approaches used can be divided into three categories: a) morphological analysis of different tissues and cells, b) biochemical analysis of nuclear proteins and c) analysis of the transcriptional activity in genomic-wide level. Initially, the following tissues were studied in paraffin sections: skin, spleen, small intestine, large intestine, stomach, liver, kidney, brain, heart and lungs. At the same time, immunohistochemical stains were performed in paraffin sections, cryosections or smears (isolated splenocytes), using antibodies against the nuclear lamins, LBR or keratins 8 and 19. Finally, the ability of T-lymphocytes to transit from the quiescent state (G0) to proliferative state, after induction with PHA, was examined. These experiments showed that the architecture of most tissues and the distribution of the proteins studied were not affected by mutations in LBR. Nevertheless, from the morphological study it would appear that alopecia, which is observed in homozygous animals, is due to the selective epidermal hyperplasia of the stratum conreum, whereas cachexia, which eventually leads to death, can be correlated to intestinal epithelium lesions. This idea is based on the fact that the epithelium of the small instestine in homozygous animals is characterized by the presence of chromatin clumps in the nuclear envelope that produce an interesting “mosaic” phenotype. The morphological analysis which we performed was complemented by biochemical analysis of the post-translational modifications in histones H3 and H2A with mass spectrometry. Pull down experiments were also performed by using the three heterochromatin protein 1 (HP1) isoforms and LBR as “baits”. The above experiments did not reveal any significant differences between the wild type and the mutant animals. The above data, in combination with the cachectic phenotype of the homozygous animals, made necessary the use of DNA microarray technology, so that the change in transcriptional activity of the genes which are expressed in the small intestine can be examined. This kind of analysis revealed 149 target-genes, whose transcriptional activity is notably different in homozygous animals. Many of these genes correspond to transcription factors, while other relate (directly or indirectly) to the intake and ingestion of nutrients. Smad3 and Banf1 genes presented an increase of their RNA levels and this was confirmed by the use of Real-Time PCR. The same was performed for the Areg, Reg3b/Pap, Vimentin and I-FABP2 genes. From our study it can be concluded that LBR plays an important role in the transcriptional control of specific genes, a view that is in good agreement with recent results that have been approved in the recent literature. 149 σ.