Μελέτη της παθογένειας των μυελικών κακοηθειών με έμφαση στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA

Η Οξεία Μυελογενής Λευχαιμία (AML) είναι μια απειλητική για τη ζωή μυελική κακοήθεια, της οποίας η θεραπεία συνίσταται στο συνδυασμό των κυτταροτοξικών παραγόντων ιδαρουβικίνη και κυτταραβίνη σε ασθενείς που είναι επιλέξιμοι για εντατική χημειοθεραπεία. Δυστυχώς, το ποσοστό αποτυχίας στο συνδυασμό (αντίσταση στη θεραπεία ή υποτροπή της νόσου) είναι υψηλό, με αποτέλεσμα να είναι επιτακτική η ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπειών. O μηχανισμός ανταπόκρισης στη βλάβη του DNA (DDR) αποτελεί ένα εκτεταμένο δίκτυο βιολογικών μορίων και μονοπατιών που δρουν με σκοπό την αναστολή του κυτταρικού κύκλου εώς την επιδιόρθωση της βλάβης του DNA, διαφορετικά οδηγούν το κύτταρο στην απόπτωση. Χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές AML μετά την έκθεσή τους σε ιδαρουβικίνη και κυτταραβίνη, μελετήσαμε την έκφραση 84 γονιδίων που εμπλέκονται στο μηχανισμό DDR, μέσω ανάλυσης συστοιχιών αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Επιλέξαμε πέντε γονίδια DDR (PPP1R15A, CDKN1A, GADD45A, GADD45G και EXO1) των οποίων η έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη στα ζώντα λευχαιμικά κύτταρα μετά την επίδραση της χημειοθεραπείας in vitro. Στη συνέχεια μελετήσαμε την έκφρασή τους σε δείγματα διάγνωσης 74 ασθενών με de novo AML και 30 δειγμάτων ελέγχου. Η έκφραση και των πέντε αυτών γονιδίων DDR φάνηκε ότι αυξάνεται στα δείγματα των ασθενών με την αύξηση του κυτταρογενετικού κινδύνου. Επιπλέον, το γονιδίο PPP1R15A εμφάνιζε σημαντικά αυξημένη έκφραση στα δείγματα AML σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Κατόπιν, προχωρήσαμε σε αποσιώπηση και καταστολή του γονιδίου PPP1R15A σε κυτταρικές σειρές AML σε δύο ανεξάρτητα πειράματα χρησιμοποιώντας τις μεθόδους siRNA και CRISPR-cas9 αντίστοιχα. Η βιωσιμότητα των λευχαιμικών κυττάρων δεν επηρεαζόταν από τη μείωση της έκφρασης του PPP1R15A. Μετά την επίδραση χημειοθεραπείας όμως, ήταν σημαντικά μειωμένη σε σχέση με αυτή των λευχαιμικών κυττάρων με διατηρημένη έκφραση του PPP1R15A και στα δύο πειράματα. Τα ευρήματά μας επισημαίνουν ότι ο μηχανισμός DDR υπερεκφράζεται σε ασθενείς με υψηλό κυτταρογενετικό κίνδυνο, αναντανακλώντας αυξημένο γενοτοξικό stress. Ειδικότερα, το γονίδιο PPP1R15A σχετίζεται με την επιβίωση του κυττάρου από το stress. Η μείωση της έκφρασής του μπορεί να είναι ένας ασφαλής και αποτελεσματικός τρόπος για την αύξηση της χημειοευαισθησίας στην AML. Acute Myeloid Leukemia (AML) is a life-threatening myeloid malignancy whose induction treatment consists of combination chemotherapy with idarubicin and cytarabine for fit patients. Treatment failures (primary resistance to treatment or disease relapse) are frequent, urging the need for the development of novel treatments for this disease. The DNA Damage Response Mechanism (DDR) comprises numerous molecules and pathways intended to arrest the cell cycle until DNA damage is repaired or else drive the cell to apoptosis. AML-derived cell lines after treatment with idarubicin and cytarabine were used for studying the expression profile of 84 DDR genes, through polymerase chain reaction (PCR) arrays. We chose 5 DDR genes (PPP1R15A, CDKN1A, GADD45A, GADD45G, and EXO1), which exhibited increased expression in live cells after chemotherapy treatment in vitro. Consequently, we studied their expression in 74 de novo AML patient and 30 control samples. All five DDR genes were overexpressed in AML samples with increasing cytogenetic risk. Moreover, we found PPP1R15A expression to be increased in AML compared to control samples. Next, we performed PPP1R15A silencing in AML cell lines in two separate experiments using siRNA and CRISPR-cas9, respectively. Cell viability was not affected by PPP1R15A downregulation alone. However, it was markedly decreased upon treatment with Idarubicin and Cytarabine in both experiments compared to cell lines with preserved PPP1R15A expression. Our findings highlight that DDR regulators demonstrate increased expression in patients with high cytogenetic risk possibly reflecting increased genotoxic stress. Especially, PPP1R15A is mainly involved in the recovery of the cells from stress. Its downregulation might be a safe and effective way to increase sensitivity to chemotherapy in this disease.