Efeito dos peptídeos salivares derivados de estaterina e histatina na aderência do Streptococcus mutans e na desmineralização do esmalte provocada por biofilmes cariogênicos

Orientadores: Jaime Aparecido Cury, Walter Luiz Siqueira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba e The University of Western Ontario Resumo: O biofilme dental é formado nas superfícies dentárias recobertas por uma camada de proteínas e peptídeos salivares conhecida por película de esmalte adquirida (PAE). Previamente foi demonstrado que os peptídeos salivares modificados de estaterina e histatina, DR9-DR9 e DR9-RR14, foram capazes de reduzir a desmineralização do esmalte e exibir atividade antimicrobiana contra Streptococcus mutans, respectivamente, mas em condições experimentais que não imitaram o desenvolvimento de cárie induzida por biofilme e exposição à sacarose, o açúcar mais cariogênico da dieta. Nesta tese avaliou-se o efeito dos peptídeos salivares modificados sobre 1) a aderência de S. mutans à hidroxiapatita (HAp), e 2) na redução da desmineralização do esmalte, usando um modelo validado de biofilme cariogênico de S. mutans. Nossa hipótese foi que os peptídeos DR9-DR9 e DR9-RR14 reduziriam a adesão de S. mutans e a cariogenicidade dos biofilmes, protegendo o esmalte contra a desmineralização. Para testar essa hipótese, foram realizados dois estudos in vitro. No primeiro estudo, discos de hidroxiapatita foram tratados com os peptídeos para induzir a formação de PAE e depois inoculados com S. mutans para quantificação de bactérias aderidas, e para avaliar os proteomas bacterianos totais após os períodos de adesão de 2 h, 4 h e 8 h. No segundo estudo, um modelo in vitro de biofilme cariogênico foi validado e usado para testar o efeito dos tratamentos com os peptídeos DR9-DR9 e DR9-RR14 na desmineralização do esmalte sob duas condições: 1) quando adsorvidos na superfície do esmalte, formando a PAE, e 2) quando usados para tratar os biofilmes 2x/dia. Os biofilmes foram crescidos por 144 h e foi avaliado o efeito dos peptídeos na desmineralização do esmalte, biomassa e nos proteomas bacterianos da matriz extracelular e total. Os resultados mostraram que o peptídeo DR9-DR9 reduziu a aderência de S. mutans à HAp, mas DR9-DR9 e DR9-RR14 não tiveram efeito significativo no desenvolvimento dos biofilmes cariogênicos formados. Os peptídeos modificados não modularam o proteoma bacteriano, nem quando aderidos à PAE nem quando usados para tratar os biofilmes em formação. Entretanto, DR9-DR9 e DR9-RR14 reduziram significativamente a desmineralização do esmalte, sugerindo que podem controlar o desenvolvimento de cárie através de um mecanismo físico-químico. O efeito combinatório de reduzir a aderência bacteriana e limitar a perda mineral da estrutura dentária sob alto desafio cariogênico sugere que os peptídeos modificados DR9-DR9 e DR9-RR14 representam uma nova abordagem translacional para a prevenção/tratamento da cárie dentária Abstract: Dental biofilm is formed onto dental surfaces covered by a layer of specific salivary proteins and peptides named acquired enamel pellicle (AEP). It was previously demonstrated that the statherin- and histatin-derived engineered salivary peptides DR9-DR9 and DR9-RR14 were able to reduce enamel demineralization and displayed antimicrobial activity against Streptococcus mutans, respectively. However, these studies were carried under experimental conditions that did not mimic caries development induced by biofilm and sucrose exposure, the most cariogenic dietary sugar. In this thesis we assessed the effect of the engineered salivary peptides on 1) the adherence of S. mutans to hydroxyapatite (HAp), and 2) the reduction of enamel demineralization, using a validated S. mutans cariogenic biofilm model. We hypothesized that DR9-DR9 and DR9-RR14 would reduce S. mutans adherence and the cariogenicity of the biofilms, protecting enamel against demineralization. To test this hypothesis, we conducted two in vitro studies. In the first study, hydroxyapatite discs were treated with the peptides to induce AEP formation and then inoculated with S. mutans to quantify adhered bacteria, and to evaluate the total bacterial proteomes after adhesion periods of 2 h, 4 h, and 8 h. In the second study, a validated in vitro cariogenic S. mutans biofilm model was used to test the effect of DR9-DR9 and DR9-RR14 on enamel demineralization under two conditions 1) adsorbed onto the enamel surface forming the AEP, and 2) used to treat the biofilms 2x/day. Biofilms were grown for 144 h and the effect of the peptides on enamel demineralization, biomass, and total and extracellular matrix bacterial proteomes were evaluated. Results showed that DR9-DR9 reduced S. mutans adherence to HAp, but DR9-DR9 and DR9-RR14 did not have a significant effect on the development of the cariogenic biofilms formed. The engineered peptides did not modulate the bacterial proteome, neither when adhered to AEP nor when used to treat the biofilms during their formation. However, DR9-DR9 and DR9-RR14 significantly reduced enamel demineralization, suggesting that they control caries development by a physicochemical mechanism. The combinatory effect of reducing bacteria adhesion and limiting the mineral loss from the dental structure under high cariogenic challenge, suggests that the engineered peptides DR9-DR9 and DR9-RR14 represent a new translational approach for the prevention/treatment of dental caries Doutorado Cariologia Doutora em Odontologia FAPESP 2014/27034-5; 2017/02692-8 CAPES