Identification of the linker histone H1 as a protein kinase Cε-binding protein in vascular smooth muscle.

A variety of anchoring proteins target specific protein kinase C (PKC) isoenzymes to particular subcellular locations or multimeric signaling complexes, thereby achieving a high degree of substrate specificity by localizing the kinase in proximity to specific substrates. PKCε is widely expressed in smooth muscle tissues, but little is known about its targeting and substrate specificity. We have used a Far-Western (overlay) approach to identify PKCε-binding proteins in vascular smooth muscle of the rat aorta. Proteins of ~32 and 34 kDa in the Triton-insoluble fraction were found to bind PKCε in a phospholipid/diacylglycerol-dependent manner. Although of similar molecular weight to RACK-1, a known PKCε-binding protein, these proteins were separated from RACK-1 by SDS-PAGE and differential NaCl extraction and were not recognized by an antibody to RACK-1. The PKCε-binding proteins were further purified from the Triton-insoluble fraction and identified by de novo sequencing of selected tryptic peptides by tandem mass spectrometry as variants of the linker histone H1. Their identity was confirmed by Western blotting with anti-histone H1 and the demonstration that purified histone H1 binds PKCε in the presence of phospholipid and diacylglycerol but absence of Ca2+. The interaction of PKCε with histone H1 was specific since no interaction was observed with histones H2A, H2S or H3S. Bound PKCε phosphorylated histone H1 in a phospholipid/diacylglycerol-dependent but Ca2+-independent manner. Ca2+-dependent PKC was also shown to interact with histone H1 but not other histones. These results suggest that histone H1 is both an anchoring protein and a substrate for activated PKCε and other PKC isoenzymes and likely serves to localize activated PKCs that translocate to the nucleus in the vicinity of specific nuclear substrates including histone H1 itself. Since PKC isoenzymes have been implicated in regulation of gene expression, stable interaction with histone H1 may be an important step in this process. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Une variété de protéines d'ancrage ciblent des isoformes spécifiques de la protéine kinase C (PKC) vers des sites sub-cellulaires particuliers ou vers des complexes signalétiques multimériques, permettant de ce fait un haut degré de spécificité de substrat en localisant la kinase à proximité de ces substrats spécifiques. La PKCε est largement distribuée dans le muscle lisse, mais on connaît peu de choses quant à son ciblage et à la spécificité de ses substrats. Nous avons utilisé une approche de Far-Western afin d'identifier les protéines liant la PKCε dans le muscle lisse vasculaire d'aorte de rat. Des protéines d'environ 32 et 34 kDa, présentes dans la fraction insoluble dans le Triton, lient la PKCε de façon dépendante des phospholipides et du diacylglycérol. Quoique de poids moléculaire similaire à RACK-1, une protéine connue liant la PKCε, ces protéines se séparent de RACK-1 en électrophorèse sur SDS-PAGE et par extraction différentielle au NaCl, et ne sont pas reconnues par un anticorps anti-RACK-1. Les protéines liant la PKCε ont été purifiées à partir de la fraction insoluble dans le Triton et identifiées par séquençage de novo de peptides tryptiques en spectrométrie de masse comme étant des variants de l'histone H1. Leur identité a été confirmée par immuno-buvardage avec un anti-histone H1, ainsi que par la démonstration que l'histone H1 purifiée lie la PKCε en présence de phospholipides et de diacylglycérol, mais en absence de Ca+2. L'interaction entre la PKCε et l'histone H1 est spécifique car aucune interaction n'est observée avec les histones H2A, H2S ou H3S. La PCKε liée phosphoryle l'histone H1 de façon dépendante des phospholipides et du diacylglycérol, mais de façon indépendante du Ca+2. Les formes de PKC dépendantes du Ca+2 peuvent aussi interagir avec l'histone H1, mais pas avec les autres histones. Ces résultats suggèrent que l'histone H1 est à la fois une protéine d'ancrage et un substrat pour la PKCε activée et autres isoenzymes de PKC et sert probablement à localiser les PCKs activées, en translocation vers le noyau, au voisinage de substrats nucléaires spécifiques incluant l'histone H1 elle-même. Puisque les isoenzymes de PKC sont impliquées dans la régulation de l'expression génique, une interaction stable avec l'histone H1 peut être une étape importante de ce processus. [ABSTRACT FROM AUTHOR]