Functional reconstitution of an unusual Firmicutes σ factor into a Gram-negative heterologous host.

Sigma (σ) factors are single-subunit proteins that reversibly bind RNA polymerase and play an important role in the transcription initiation process. An unusual 2-subunit σ factor, consisting of proteins SigO and RsoA, activates transcription from a group of related promoters in Bacillus subtilis. These 2 proteins specifically interact with each other and with RNA polymerase subunits. This system is widespread among species in several Bacillus-related genera, but otherwise appears restricted to the Firmicutes. Here, we reconstituted SigO-RsoA, and a cognate promoter, into the distantly related heterologous host Escherichia coli to examine whether this system can function in bacteria outside of the Firmicutes. We show that these proteins can productively associate with E. coli RNA polymerase and activate transcription, demonstrating that there are no structural barriers to function. In parallel, we tested a wide array of protein-protein interaction mutations and promoter mutations that impact SigO-RsoA function in both B. subtilis and E. coli and conclude that the SigO-RsoA system behaves, in most instances, similarly in both genetic backgrounds. These data raise the possibility of genetically isolating the system in this heterologous host and away from unknown B. subtilis factors that may also be playing a role in SigO-RsoA regulatory pathways, thus facilitating further study of the system. As a result of this work, we also provide a comprehensive mutational analysis of a SigO-RsoA promoter and report the preliminary identification of amino acids in SigO that play a role in mediating the SigO-RsoA protein-protein interaction. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Les facteurs σ sont des protéines à sous-unité simple qui se lient à l'ARN polymérase de manière réversible et jouent un rôle important dans le processus d'initiation de la transcription. Un facteur σ singulier comprenant deux sous-unités, soit les protéines SigO et RsoA, active la transcription à partir d'un groupe de promoteurs analogues chez Bacillus subtilis. Ces 2 protéines interagissent spécifiquement entre elles et avec des sous-unités de l'ARN polymérase. Ce système est répandu chez des espèces de genres proches de Bacillus, mais on ne le retrouve pas en dehors des Firmicutes. Dans le présent ouvrage, nous avons reconstitué SigO-RsoA et un promoteur adapté chez la bactérie hôte hétérologue Escherichia coli, à la phylogénie éloignée, afin de déterminer si ce système peut fonctionner dans des bactéries autres que les Firmicutes. Nous révélons que ces protéines peuvent s'associer de manière productive avec l'ARN polymérase d' E. coli et activer la transcription, démontrant ainsi l'absence d'éléments structuraux faisant obstacle au fonctionnement. En parallèle, nous avons analysé un large éventail de mutations touchant les interactions protéine-protéine et le promoteur pour en déterminer l'impact sur le fonctionnement de SigO-RsoA, tant chez B. subtilis que chez E. coli, et avons conclu que le système SigO-RsoA se comporte la plupart du temps de la même manière dans les 2 contextes génétiques. Ces données laissent entrevoir la possibilité d'isoler génétiquement le système dans cet hôte hétérologue de sorte qu'il ne soit pas influencé par des facteurs de B. subtilis non identifiés pouvant jouer un rôle dans les voies régulatrices SigO-RsoA, facilitant ainsi l'étude du système. Grâce à ces recherches, nous sommes également en mesure de présenter une analyse mutationnelle exhaustive d'un promoteur SigO-RsoA et de rapporter l'identification préliminaire d'acides aminés de SigO jouant un rôle dans l'interaction protéine-protéine SigO-RsoA. [Traduit par la Rédaction] [ABSTRACT FROM AUTHOR]