نبذة مختصرة : Les variants en GBA1, gen que codifica la β-glucocerebrosidasa lisosomal (β-GCasa), constitueixen el factor de risc genètic més freqüent per a la malaltia de Parkinson (EP), definint una entitat clínica i biològica particular (EP-GBA). La reducció de l’activitat β-GCasa afavoreix l’acumulació dels seus substrats esfingolipídics, com les glucosilceramides (GluCer) i derivats com la glucosilesfingosina (GluSph), juntament amb alteracions en l’homeòstasi lipídica, lisosomal i del reticle endoplasmàtic, el tràfic vesicular, les vies d’autofàgia i la funció mitocondrial. Aquests processos promouen l’acumulació d’α-sinucleïna i la formació d’agregats insolubles, generant un entorn d’estrès cel·lular que contribueix a la neurodegeneració. La caracterització bioquímica d’aquestes alteracions és fonamental per aprofundir en els mecanismes de la malaltia i avançar en el desenvolupament de biomarcadors que permetin l’estratificació clínica i la monitorització de teràpies, en línia amb estratègies de medicina personalitzada. Tanmateix, l’elevada variabilitat de resultats entre estudis limita la comparació i la interpretació, degut en gran part a la manca d’harmonització i de robustesa dels mètodes in-house emprats. Aquesta tesi se centra en el desenvolupament, avaluació i aplicació de mètodes basats en cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS) per quantificar esfingolípids en diferents matrius com a biomarcadors potencials. Es van optimitzar mètodes basats en cromatografia de fase inversa per quantificar hexosilceramida (HexCer) i hexosilesfingosina (HexSph) en pellets cel·lulars, sèrum i teixits murins, permetent caracteritzar alteracions consistents amb la literatura i monitoritzar l’eficàcia de teràpies experimentals. A més, es va desenvolupar i avaluar un mètode basat en cromatografia per interacció hidrofílica (HILIC) per quantificar isoformes de GluCer i galactosilceramida (GalCer) en líquid cefaloraquidi (LCR) humà. La seva aplicació a la cohort Vall d’Hebron Initiative for Parkinson (VHIP) va revelar tendències en les ràtios GluCer/GalCer més elevades en pacients amb EP-GBA respecte als controls, més pronunciades en portadors de variants severes en GBA1. La manca de recomanacions harmonitzades entre guies internacionals dificulta l’avaluació de paràmetres que impacten en la precisió, veracitat i sensibilitat dels mètodes LC-MS/MS, com l’efecte matriu. La complexitat estructural dels esfingolípids, la presència de múltiples analits endògens i les matrius biològiques complexes o de disponibilitat limitada incrementen aquest desafiament. Per abordar-lo, aquesta tesi proposa un flux de treball sistemàtic que integra múltiples estratègies, acompanyat d’una eina que automatitza els càlculs, facilitant l’avaluació integral de l’efecte matriu i afavorint l’adherència a les recomanacions de les guies internacionals. En conjunt, el treball estableix un marc experimental i analític que connecta troballes preclíniques i clíniques, aporta eines transferibles per a la validació de mètodes i dona suport a l’ús de glicoesfingolípids (GSL) com a biomarcadors en EP-GBA.
نبذة مختصرة : Las variantes en GBA1, gen que codifica la β-glucocerebrosidasa lisosomal (β-GCasa), constituyen el factor de riesgo genético más frecuente para la enfermedad de Parkinson (EP), definiendo una entidad clínica y biológica particular (EP-GBA). La reducción de la actividad β-GCasa favorece la acumulación de sus sustratos esfingolipídicos, como las glucosilceramidas (GluCer) y derivados como la glucosilesfingosina (GluSph), junto con alteraciones en la homeostasis lipídica, lisosomal y del retículo endoplasmático, el tráfico vesicular, las vías de autofagia y la función mitocondrial. Estos procesos promueven la acumulación de α-sinucleína y la formación de agregados insolubles, generando un entorno de estrés celular que contribuye a la neurodegeneración. La caracterización bioquímica de estas alteraciones es fundamental para profundizar en los mecanismos de la enfermedad y avanzar en el desarrollo de biomarcadores que permitan la estratificación clínica y la monitorización de terapias, en línea con estrategias de medicina personalizada. Sin embargo, la elevada variabilidad de resultados entre estudios limita la comparación de grupos y la interpretación de los datos, debido en gran parte a la falta de armonización y robustez en los métodos in-house empleados. Esta tesis se centra en el desarrollo, evaluación y aplicación de métodos basados en cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tandem (LC-MS/MS) para cuantificar esfingolípidos en distintas matrices como potenciales biomarcadores. Se optimizaron métodos basados en cromatografía de fase reversa para cuantificar hexosilceramida (HexCer) y hexosilesfingosina (HexSph) en pellets celulares, suero y tejidos murinos, permitiendo caracterizar alteraciones consistentes con la literatura y monitorizar la eficacia de terapias experimentales. Además, se desarrolló y evaluó un método basado en cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) para cuantificar isoformas de GluCer y galactosilceramida (GalCer) en líquido cefalorraquídeo (LCR) humano. Su aplicación en la cohorte Vall d’Hebron Initiative for Parkinson (VHIP) reveló tendencias en las ratios GluCer/GalCer más elevadas en pacientes con EP-GBA respecto a controles, más pronunciadas en portadores de variantes severas en GBA1. La falta de recomendaciones armonizadas entre guías internacionales dificulta la evaluación de parámetros que impactan en la precisión, veracidad y sensibilidad de los métodos LC-MS/MS, como el efecto matriz. La complejidad estructural de los esfingolípidos, la presencia de múltiples analitos endógenos y las matrices biológicas complejas o de disponibilidad limitada aumentan este desafío. Para abordarlo, esta tesis propone un flujo de trabajo sistemático que integra múltiples estrategias, acompañado de una herramienta que automatiza los cálculos, facilitando la evaluación integral del efecto matriz, y favoreciendo la adherencia a las recomendaciones de las guías internacionales. En conjunto, el trabajo establece un marco experimental y analítico que conecta hallazgos preclínicos y clínicos, aporta herramientas transferibles para la validación de métodos y respalda el uso de glicoesfingolípidos (GSL) como biomarcadores en EP-GBA.
Variants in GBA1, the gene encoding lysosomal β-glucocerebrosidase (β-GCase), represent the most common genetic risk factor for Parkinson’s disease (PD), defining a distinct clinical and biological subtype (PD-GBA). Reduced β-GCase activity promotes the accumulation of its sphingolipid substrates, such as glucosylceramides (GluCer) and derivatives like glucosylsphingosine (GluSph), along with alterations in lipid, lysosomal, and endoplasmic reticulum homeostasis, vesicular trafficking, autophagy pathways, and mitochondrial function. These processes lead to α-synuclein accumulation and the formation of insoluble aggregates, generating a cellular stress environment that contributes to neurodegeneration. The biochemical characterization of these alterations is essential to further investigate disease mechanisms and to advance the development of biomarkers for clinical stratification and therapeutic monitoring, in line with personalized medicine strategies. However, the high variability of results across studies limits group comparisons and data interpretation, largely due to the lack of harmonization and robustness in the in-house methods employed. This thesis focuses on the development, evaluation, and application of liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based methods for sphingolipid quantification in various matrices as potential biomarkers. Reverse-phase chromatography methods were optimized to quantify hexosylceramide (HexCer) and hexosylsphingosine (HexSph) in cell pellets, serum, and mouse tissues, enabling the identification of alterations consistent with existing literature and the monitoring of experimental therapies. In addition, a hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) method was developed and evaluated to quantify GluCer and galactosylceramide (GalCer) isoforms in human cerebrospinal fluid (CSF). Its application in the Vall d’Hebron Initiative for Parkinson (VHIP) cohort revealed higher GluCer/GalCer ratios in PD-GBA patients compared to controls, particularly in carriers of severe GBA1 variants. The lack of harmonized recommendations across international guidelines limits the evaluation of parameters affecting the accuracy, precision, and sensitivity of LC-MS/MS methods, such as matrix effects. The structural complexity of sphingolipids, the presence of multiple endogenous analytes, and the complexity or limited availability of biological matrices increase this challenge. To address it, this thesis proposes a systematic workflow integrating multiple strategies, supported by a tool that automates calculations to facilitate comprehensive matrix effect evaluation and adherence to international guidelines. Altogether, this work establishes an experimental and analytical framework that bridges preclinical and clinical findings, provides transferable tools for method validation, and supports the use of glycosphingolipids (GSLs) as biomarkers in PD-GBA.
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina
Processing Request
No Comments.